论文摘要
[目的]体外培养脑胶质瘤细胞,从中分离鉴定脑肿瘤干细胞样细胞（brain tumor stem-like cells, BTSCs）;观察BTSCs的生物学特性,包括形态学、单克隆形成率、增殖曲线、成瘤能力以及分化能力；通过多种方法比较负性共刺激分子B7-H1在BTSCs和非BTSCs中的表达；体外实验观察BTSCs的免疫学特性,以及是否较非BTSCs更利于通过B7-H1途径逃逸机体的免疫监控。[方法]用无血清培养液（含EGF、bFGF和B27）培养6例原代胶质母细胞瘤和1例人脑胶质瘤细胞系U87,观察其在不同培养条件下（无血清和含血清培养）的生长特性。流式细胞术检测无血清培养条件下的原代胶质母细胞瘤A2B5和CD133的表达率。用流式细胞仪分选无血清培养的U87和原代胶母细胞,将其分为A2B5阳性细胞群和A2B5阴性细胞群,比较两群细胞在无血清培养条件下的生长形态；单克隆形成实验和XTT法比较这两群细胞以及未分选胶母细胞的增殖能力；免疫荧光法鉴定干细胞标志物的表达以及血清培养液诱导分化后的分化标志物的表达；裸鼠腹股沟皮下注射观察两群细胞的成瘤能力,以鉴定BTSCs.分别用免疫荧光法、Western Blot法和流式细胞术检测负性共刺激分子B7-H1在6例原代胶质母细胞瘤分选后得到的A2B5阳性细胞群和A2B5阴性细胞群中的表达情况,并比较两者的差别；用流式双标法检测U87细胞系以及本实验室长期培养的SHG62、SHG66细胞系A2B5和B7-H1的表达情况,并比较B7-H1在长期离体培养条件下的A2B5阳性细胞群和A2B5阴性细胞群中表达情况的差别。将原代胶质母细胞瘤分选后得到的A2B5阳性细胞群和A2B5阴性细胞群分别制备抗原；提取患者自体外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）,其中的贴壁细胞经GM-CSF和IL-4刺激诱导上调树突状细胞（dendritic cells,DCs）匕例,分别加入上述两群抗原后获得成熟DCs,之后与来自PBMCs的非贴壁细胞共培养获得活化的效应细胞（即cytotoxic T lymphocytes, CTLs）,然后分多组用CSFE/PI法进行杀伤实验、XTT法进行特异性T细胞增殖实验,比较A2B5阳性细胞群和A2B5阴性细胞群的免疫学特性、以及对B7-H1进行干预前后各组实验结果的差别。将未分选的人胶质母细胞瘤细胞系U87在三种条件下培养：1)有血清贴壁培养;2)无血清悬浮培养;3)放化疗干预条件下无血清悬浮培养。分别检测对B7-H1进行干预前后T细胞对各组细胞杀伤率的差别。[结果]原代胶质母细胞瘤在无血清培养条件下部分呈悬浮生长形成肿瘤球、部分呈贴壁生长；U87细胞在无血清培养条件下呈悬浮生长。原代脑胶质瘤细胞经流式分选后得到的A2B5阳性细胞呈悬浮生长,并形成肿瘤球;A2B5阴性细胞亦呈悬浮生长,但极少能形成肿瘤球。单克隆形成实验发现5.73%±0.64%的A2B5阳性细胞能形成单细胞克隆球、未分选的细胞有3.01%±0.50%能形成单细胞克隆球、而A2B5阴性细胞的单克隆形成率为0%；通过XTT法绘制生长曲线时发现A2B5阳性细胞在无血清培养液下的生长速度较未分选细胞和A2B5阴性细胞快。体内成瘤实验发现106个A2B5阳性细胞能在裸鼠皮下成瘤,H & E染色提示继发肿瘤符合脑胶质瘤的典型组织学特性；A2B5阴性细胞多至107级别亦不能在裸鼠皮下成瘤。免疫荧光染色发现无血清培养条件下的A2B5阳性细胞表达干细胞标记物Nestin和CD133;在含血清分化培养条件下表达分化标记物GFAP、β-tubulin和CNPase。流式双标染色结果表明：A2B5阳性细胞中含有CD133阳性细胞及CD133阴性细胞；而A2B5阴性细胞均为CD133阴性细胞,不存在A2B5-CD133+细胞,A2B5阳性细胞囊括了所有CD133阳性胶质瘤细胞。通过对原代胶质母细胞瘤分选后得到的两群细胞进行免疫荧光染色,我们发现：A2B5阳性细胞和A2B5阴性细胞均能表达负性共刺激分子B7-H1,并且A2B5阳性细胞B7-H1的表达水平较A2B5阴性细胞高；对上述两群细胞进行Western Blot法检测B7-H1蛋白的结果表明：B7-H1蛋白在A2B5阳性胶质瘤干细胞样细胞中的表达水平较A2B5阴性肿瘤细胞高；对上述两群细胞进一步采用流式细胞术检测B7-H1的表达量,结果提示：A2B5阳性细胞和A2B5阴性细胞均能表达负性共刺激分子B7-H1,但B7-H1在前者的表达水平高于后者（39.50%±8.76%Vs16.41%±5.41%）。对长期体外培养的脑胶质瘤细胞系进行流式双标法检测结果提示：B7-H1在A2B5阳性细胞和A2B5阴性细胞中的表达率分别为31.22%±24.04%和42.52%±25.20%,两者之间的差异未达到统计学显著性。通过肿瘤抗原致敏DCs体外细胞毒实验（杀伤实验）我们发现：BTSCs抗原致敏的效应细胞较非BTSCs抗原致敏的效应细胞对肿瘤细胞（不管是BTSCs还是非BTSCs）的杀伤活性高（19.09%±2.89%Vs 12.69%±3.47%;30.05%±4.98%Vs23.09%±1.04%,P<0.05）；用同种抗原致敏的效应细胞（不管是用BTSCs抗原还是以非BTSCs抗原致敏）对于BTSCs的杀伤率低于对非BTSCs的杀伤率（19.09%±2.89%Vs 30.05%±4.98%；12.69%±3.47%Vs 23.09%±1.04%,P<0.01）；利用封闭抗体将B7-H1封闭后效应细胞对于BTSCs的杀伤率明显增加（29.77%±3.05%Vs 19.09%±2.89%,P<0.01）,平均增加率为55.95%,而效应细胞对于非BTSCs的杀伤率增加不显著（33.71%±6.08%Vs 30.05%±4.98%,P>0.05）,效应细胞对于BTSCs和非BTSCs的杀伤率无统计学差异（29.77%±3.05%Vs33.71%±6.08%,P>0.05）。通过特异性T细胞增殖实验我们发现：A2B5+BTSCs能显著抑制自体T细胞的增殖,将B7-H1配体封闭后T细胞的增殖活性部分恢复；A2B5-细胞对自体T细胞的增殖活性抑制不明显。通过对在三种不同培养条件下的U87细胞进行杀伤实验,按第1)、第2)、第3)组肿瘤细胞,未封闭B7-H1在前、封闭了B7-H1在后的顺序,T细胞杀伤率依次为：24.56%、25.70%、17.00%、12.80%、24.30%和23.18%；通过统计分析,我们发现：将B7-H1封闭前后三组肿瘤细胞的平均被杀伤率分别为21.95%±4.29%和20.56%±6.84%,两者之间的差异未达到统计学显著性。[结论]A2B5阳性胶质瘤细胞具有BTSCs特性,且A2B5阳性胶质瘤细胞囊括了所有CD133+BTSCs,表明A2B5能作为分选BTSCs的一种高效标记;A2B5+BTSCs能诱导产生免疫抑制,而A2B5-非BTSCs不具有免疫抑制性；A2B5+BTSCs不仅在数量上较A2B5-非BTSCs高表达负性共刺激分子B7-H1,且在功能上更利于通过B7-H1途径实施免疫逃逸；将PD-1/B7-H1负性共刺激途径封闭后能显著提高免疫细胞对于A2B5+BTSCs的杀伤活性；长期体外培养（超过100代）缺乏免疫刺激的U87细胞表面B7-H1分子可能无负性免疫调节功能。
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相关论文文献
- [1].建立人源A2B5+/CD133–的胶质瘤亚群干细胞样细胞株的实验研究[J]. 中国细胞生物学学报 2018(07)
- [2].MiR-218-5p抑制A2B5~+/CD133~–亚群胶质瘤干细胞的干性维持及侵袭性[J]. 中国细胞生物学学报 2015(04)