水稻黄绿叶基因502YS及早衰基因D475的遗传鉴定及图位克隆

论文摘要

1水稻早衰突变体d475的遗传分析与基因定位衰老是植物生命周期的必然过程,但植物早衰严重影响植物的光合效率。水稻是我国最重要的粮食作物之一。水稻早衰现象的发生将使水稻产量下降。研究水稻早衰机理,调控水稻衰老过程和培育抗衰老的水稻品种对提高水稻产量具有积极意义。本研究利用化学诱变剂EMS（甲基磺酸乙酯）处理水稻品种日本晴,获得一份稳定遗传的早衰突变体d475,利用图位克隆的方法完成控制此早衰性状基因的精细定位,为进一步克隆该基因,阐明水稻叶片早衰的分子机制奠定基础。主要研究结果如下：（1）突变体d475的形态特征及主要农艺性状的表现：从孕穗期开始,突变体下部老叶从叶尖开始变白并逐渐向叶基部扩散,之后叶片开始变黄,出现褐色斑点,随后慢慢变得干枯。成熟期后,叶片尖端螺旋卷曲,整个叶片焦黄干枯。通过田间调查发现,与野生型相比,d475在株高、穗长有不同程度的下降,籽粒全部为秕粒,严重影响水稻生产。（2）d475的遗传分析：将d475突变体分别与明恢63和冈46B杂交,F1代的水稻植株全部表现为正常植株,F2植株在生长后期分为正常绿色植株和早衰植株2种类型,经过卡方（矛）测验,两种表型的植株分离比符合3：1,表明此早衰突变性状受1对隐性核基因控制。（3）D475突变基因的精细定位及候选基因的分析：以d475与明恢63杂交的F2作为初步定位群体,利用SSR引物和插入/缺失分子标记（In/Del）将D475初步定位到水稻第10染色体长臂上的In/Del分子标记Sl和S6之间。为进一步精细定位,构建d475与冈46B杂交的F2群体,从中选择642株突变表型的植株作为精细定位群体,最终将D475基因定位到38.31kb范围内。该区间共有8个基因,其中4个基因编码成熟相关家族蛋白质前体,目的基因可能是其中一个。下一步需要通过突变体与野生型基因的序列对比及功能互补实验,从而确定目的基因。2水稻黄绿叶基因502YS的图位克隆绿色植物进行光合作用产生的有机物直接或间接为地球上所有动物提供食物。水稻作为世界超过半数人的主食,研究其光合作用机理及叶绿素的生物合成非常重要。本实验利用化学诱变剂EMS处理水稻品种日本晴,获得一份稳定遗传的黄绿叶突变体502ys,将其与明恢63杂交获得F2群体,经过精细定位和候选基因的预测分析,再经序列对比和功能互补实验,最终确定目的基因。主要结果如下：（1）突变体502ys的形态特征及主要农艺性状的表现：从苗期开始,突变体502ys的植株叶色为黄绿色。与野生型相比,在株高、单株有效穗、穗长、穗平均粒数、结实率和千粒重都有不同程度的下降。其中,单株有效穗及结实率明显低于野生型亲本,分别减少了38.48%和16.41%。（2）502ys突变体与野生型日本晴的光合色素含量：502ys的类胡萝卜素含量为0.74 mg.g-1,比野生型日本晴下降9.76%。叶绿素a和叶绿素b含量分别是3.09 mg.g-1和0.73 mg.g-1,比野生型减少了28.17%和48.59%。（3）透射电子显微镜分析：利用透射电子显微镜观察野生型和502ys叶肉细胞的细胞结构。发现野生型的叶肉细胞叶绿体形态规则,叶绿体内的内囊体丰富,而突变体502ys的叶肉细胞的叶绿体形状不规则,体积较小且内囊体内含多个空泡,这说明突变体的叶绿体遭到破坏。（4）502ys突变性状的遗传分析：结果表明502ys受一个隐性核基因控制。（5）502YS的基因精细定位：以502ys与明恢63杂交F2群体中的332株黄绿叶突变表型植株为初步定位群体,发现502YS与水稻第2号染色体长臂上的SSR分子标记RM318、RM240和RM250有连锁关系,遗传距离分别为2.25cM、0.6cM、5.72cM、为缩小定位区间,将F2群体扩大到1169株。进一步设计多对亲本有差异的In/Del分子标记,将目的基因定位到61.03kb范围内,此区间包含14个基因。（6）502YS基因编码水稻牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸还原酶（CHLP）:结合突变体的黄绿叶性状,推断定位区间中的编码牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸还原酶（CHLP）的LOCOs02g51080可能是目的基因。将突变体LOCOs02g51080基因序列与野生型进行比对,发现在此基因第1360（位于第2个外显子）位的碱基的G（C）被颠换成A（T）,使其蛋白质的氨基酸序列的206位的甘氨酸突变成丝氨酸。此外,将LOCOs02g51080基因在突变体502ys中过量表达,所得的123株转基因阳性植株均表现为正常绿色植株,所以,LOCOs02g51080为控制502ys黄绿叶突变性状的基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 水稻早衰突变性状的研究
• 1.1 植物衰老概述
• 1.2 影响植物衰老的因素
• 1.2.1 植物激素对衰老的影响
• 1.2.2 自由基对植物衰老的影响
• 1.3 水稻早衰相关基因的研究进展
• 1.4 植物衰老研究的展望
• 2 植物叶色突变的研究
• 2.1 叶色突变体的类型及来源
• 2.2 叶色突变体的遗传方式
• 2.3 叶绿素生物合成的研究进展
• 2.3.1 从L-谷氨酸-tRNA至原卟啉Ⅸ（proto Ⅸ）的生物合成
• 2.3.2 从原卟啉Ⅸ（proto Ⅸ）至叶绿素的生物合成
• 2.4 水稻叶色突变基因研究进展
• 2.5 水稻叶色突变体的应用
• 3 水稻图位克隆技术
• 4 本研究的目的及意义
• 第二章 水稻早衰基因D475的遗传分析与精细定位
• 1. 材料与方法
• 1.1 供试材料与田间试验
• 1.2 定位群体的构建及DNA的提取
• 1.3 分子标记分析
• 1.4 生物信息学预测候选基因
• 2 结果与分析
• 2.1 突变体d475的形态特征及主要农艺性状的表现
• 2.2 d475的遗传分析
• 2.3 D475突变基因的精细定位及候选基因的分析
• 3 讨论
• 第三章 水稻黄绿叶基因502YS的图位克隆
• 1. 材料与方法
• 1.1 供试材料与田间试验
• 1.2 叶绿素及类胡萝卜素含量测定
• 1.3 透射电子显微镜分析
• 1.4 502YS的基因的精细定位
• 1.5 502YS的基因的序列分析
• 1.5.1 感受态细胞的制备
• 1.5.2 细菌的转化
• 1.6 502YS基因互补实验
• 2 结果与分析
• 2.1 突变体502ys的形态特征及主要农艺性状的表现
• 2.2 502ys突变体与野生型日本晴的光合色素含量
• 2.3 透射显微镜分析
• 2.4 502ys突变性状的遗传分析
• 2.5 502YS基因的精细定位
• 2.6 502YS基因编码水稻牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸还原酶（CHL P）
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢