对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28枯草工程菌的构建与VP28卵黄抗体的制备及其抗病性研究

论文摘要

对虾白斑综合征（WSS）是全球对虾养殖业所面临的危害性最大的病害之一,至今已席卷了世界各国的对虾养殖地区,造成巨大的经济损失。但目前尚无有效的防治手段。因此,如何预防和控制该病毒病一直是近年来研究的热点。本研究在构建wssv重组VP28抗原蛋白枯草芽孢工程菌（B. subtilis-VP28）与卵黄抗体（VP28-IgY）的基础上,经口服途径免疫克氏原螯虾,进行保护螯虾抵抗WSSV感染的效果试验,并初步研究B.subtilis-VP28和VP28-IgY的抗病机理。主要研究内容和结果如下：1新型穿梭分泌性表达载体pBES的构建在多功能穿梭克隆载体pBEC（来源于B.subtilispUB1 10和Ecoli pGEM3载体）的基础上,引入B.subtilis强启动子PEσ43和一段新天然信号肽序列,构建了一新型Bsubtilis-E. coli穿梭分泌性表达载体pBES。为评价所构建载体的表达与分泌效率,引入β-葡聚糖酶报告基因,进行分泌量动态分析。经SDS-PAGE分析及不同时间酶活测定表明,β-葡聚糖酶报告基因成功获得分泌表达,在强启动子PEσ43作用下,其单位发酵液总酶活最高可达283.45 U／ml。然而,胞外酶活最高为116.95 U／ml,分泌比例为41.26%,可见此天然信号肽分泌能力有限,还需作进一步的突变筛选。2 B. subtilis信号肽结构区域氨基酸组成与分泌效率的关系从野生型天然信号肽N区正电荷数与H区疏水性改造的角度出发,构建了一系列（15个）信号肽突变体,研究信号肽结构区域氨基酸组成与信号肽功能的关系。实验结果表明,N区的正电荷有利于提高信号肽分泌能力,但过高的电荷反而使分泌效率有所下降；H区疏水性对分泌效率影响较大,过高或过低的疏水性都不利于分泌识别过程；同时具有N区高正电荷及H区高疏水性的信号肽,反而分泌效率低；在N区高正电荷的情况下,H区中度疏水性的信号肽分泌能力最强。本研究筛出了两条具有高分泌能力的突变信号肽：H3N2 （MRARKIAGM ATSGGVAQPSSAVA）、H3N23 （MRRRKIAGMATSGGVAQPSSAVA）,报告基因胞外分泌量分别达到80.28%与80.66%,比亲本天然信号肽均提高1.95倍。本试验成功筛选并构建得到基于强启动子PEσ43与高分泌能力信号肽H3N2、H3N23的枯草芽孢杆菌高效分泌表达载体pBES-H3N2和pBES-H3N23。3 vp28基因的高效分泌表达及分泌动态分析利用构建的Bsubtilis高效分泌表达载体pBES-H3N2和pBES-H3N23,以低蛋白酶活性的B.subtilisWB600作为宿主菌,构建了重组VP28蛋白枯草芽孢工程菌B.subtilis （pBES（H3N2）-VP28）和B. subtilis （pBES（H3N23）-VP28）,vp28基因成功获得胞外分泌表达。用兔抗anti-VP28 IgG检测,具有免疫反应性。对分泌效率进行动态分析,结果显示,两株高效表达菌株均在22 h时达到最大VP28蛋白分泌量,分别为45.6 mg／L和47.4 mg／L,22 h之后分泌量略有下降,最后趋于稳定。4特异性VP28-IgY的制备与稳定性研究将表达纯化的WSSV重组VP28抗原蛋白免疫150日龄的海兰白蛋鸡,免疫三次,每隔2周免疫一次。对卵黄中特异性VP28-IgY的抗体效价及其变化规律进行检测。结果显示,在首免后第14天即可检测到特异性抗体（P/N=2.555,1：400）；第56天抗体效价达到最高（P/N=14.920,1：3200）；至120天试验结束时,抗体效价仍维持在较高水平（P/N=9.265,1：1600）。用水稀释法结合50%、33%饱和硫酸铵沉淀提纯IgY的方法,可得到特异性IgY估测纯度约为83.6%。SDS-PAGE分析提纯的IgY,发现重、轻链分别约为60 kDa与25 kDa,估算其总分子量约为170 kDa。对VP28-IgY稳定性研究表明,其在温度低于70℃、pH3.0-10.0范围内有较好的稳定性；对胃蛋白酶和渗透压具有较强的耐受性。5口服工程菌B.subtilis-VP28和VP28-IgY的螯虾体内保护效果制备芽孢期和营养期形式的工程菌Bsubtilis-VP28,并研究口服工程菌的保护效果。结果显示,以芽孢形式免疫组rVP28-bs的螯虾相对存活率均高于营养期形式组rVP28-bv,在免疫后第3、14、28天攻毒,前者相对存活率分别为65.4%、78.3%和59.7%,后者相对存活率分别为38.2%、51.7%和36.8%。为研究口服VP28-IgY中和病毒产生的保护效果,以0.01%、0.05%和0.1%的添加量添加至虾饵料,连续投喂20天后口服攻毒,相对存活率分别为48.3%、86.0%和88.3%。以上结果表明,工程菌Bsubtilis-VP28的芽孢形式,具有较理想的口服免疫效果；而以中和作用为主的VP28-IgY,其保护效果较为理想的最低添加量为0.05%。6B.subtilis-VP28和VP28-IgY抗病性机理初步研究对B.subtilis-VP28保护机理初步研究表明,工程菌Bsubtilis-VP28能特异性降低WSS的发病率,并同时激发螯虾体内非特异性免疫因子及提高抗氧化能力,从而增强虾体对WSSV的抵抗性。根据光镜、电镜观察结果推测,口服VP28-IgY（0.05%添加量）组,在攻毒后初期,螯虾体内大部分病毒被中和,另一小部分病毒侵入血细胞及其它组织细胞,但在未达到致死量或未使组织达到严重损伤时,即逐步被中和清除。Bsubtilis-VP28和VP28-IgY能中和与清除螯虾体内的病毒,并由此抑制或缓解WSSV引发的大量细胞凋亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 常见英文缩写词
• 引言
• 第一章 文献综述
• 第一节 对虾白斑综合征病毒研究进展
• 1 对虾白斑综合征病毒概况
• 2 对虾白斑综合征病毒结构蛋白的研究
• 2.1 WSSV结构蛋白
• 2.2 囊膜蛋白的结构与功能
• 2.3 囊膜蛋白VP28晶体结构
• 3 对虾白斑综合征病毒致病分子机理
• 4 对虾白斑综合征病毒防治新进展
• 4.1 亚单位疫苗
• 4.2 特异性中和抗体
• 4.3 siRNA基因干涉
• 第二节 甲壳动物的免疫系统与免疫因子
• 1 血淋巴的主要组分及其作用
• 2 凝固反应系统（Clotting system）
• 2.1 LPS介导的凝固连锁反应
• 2.2 1,3-β-D-葡聚糖介导的凝固连锁反应
• 2.3 凝固连锁反应的调控
• 3 凝集素（Lectin）家族
• 4 酚氧化物酶原激活系统（proPO）
• 5 其它防御分子
• 6 特异性免疫识别
• 第三节 枯草芽孢杆菌作为基因工程宿主菌研究进展
• 1 枯草芽孢杆菌蛋白分泌机制
• 1.1 Sec-SRP途径
• 1.2 Tat途径
• 1.3 ABC转运通道
• 1.4 提高枯草芽孢杆菌蛋白分泌能力的策略
• 2 枯草芽孢杆菌芽孢形成过程及孢衣蛋白的组装
• 2.1 芽孢形成关键事件
• 2.2 芽孢结构与孢衣蛋白组成
• 2.3 孢衣蛋白的组装
• 2.4 孢衣蛋白——芽孢表面展示系统的装载蛋白
• 3 枯草芽孢杆菌作为药用蛋白生产与递呈系统的研究
• 第四节 卵黄抗体（IgY）的结构特性与应用
• 1 卵黄抗体的形成
• 2 卵黄抗体的热稳定性和酸稳定性
• 3 卵黄抗体的结构
• 4 卵黄抗体的分离与纯化
• 5 卵黄抗体的作用机理
• 6 特异性卵黄抗体的应用与展望
• 第二章 以β-葡聚糖酶为报告基因的新型枯草芽孢杆菌分泌表达载体的构建及分泌效率研究
• 第一节 基于强启动子的穿梭型分泌表达载体的构建
• 1 试验材料
• 1.1 宿主菌和载体
• 1.2 酶、抗生素和试剂
• 1.3 培养基及主要化学试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 PCR扩增启动子-信号肽序列
• 2.3 PCR产物PCR/BPS纯化
• 2.4 双酶切PCR/BPS片段与pBEC载体
• 2.5 连接
• 2法制备E.coli TOP 10F’感受态'>2.6 CaCl₂法制备E.coli TOP 10F’感受态
• 2.7 E. coli TOP 10F’转化
• 2.8 质粒抽提
• 2.9 重组质粒鉴定和测序
• 3 结果与分析
• 3.1 启动子-信号肽片段的克隆
• 3.2 双酶切PCR/BPS片段及载体pBEC线性化
• 3.3 B.subtilis-E.coli穿梭分泌性表达载体pBES全序列
• 3.4 pBES载体启动子-信号肽序列分析
• 4 讨论
• 第二节 β-葡聚糖酶报告基因的分泌表达及分泌效率研究
• 1 试验材料
• 1.1 宿主菌和载体
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 培养基及主要化学试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 PCR扩增β-葡聚糖酶成熟肽基因mHG
• 2.2 酶切、连接
• 2.3 连接产物E.coli转化
• 2.4 重组质粒鉴定及抽提
• 2.5 化学法B.subtilis 1A751感受态制备及转化
• 2.6 B.subtilis 1A751表达菌株的构建
• 2.7 SDS-PAGE
• 2.8 分泌表达重组菌株的发酵试验
• 2.9 β-葡聚糖酶活力测定
• 3 结果与分析
• 3.1 mHG基因PCR扩增
• 3.2 含mHG报告基因的重组载体pBSG构建与转化
• 3.3 表达菌株分泌上清SDS-PAGE检测
• 3.4 表达菌株分泌动态分析
• 4 讨论
• 第三章 枯草芽孢杆菌表达载体信号肽结构区域氨基酸组成对外源蛋白分泌的影响
• 1 试验材料
• 1.1 宿主菌和载体
• 1.2 酶、培养基和试剂
• 2 试验方法
• 2.1 信号肽突变基础质粒构建及引物设计
• 2.2 信号肽突变
• 2.3 含β-葡聚糖酶基因的信号肽突变重组载体的构建
• 2.4 pBSG信号肽突变体B.subtilis转化与鉴定
• 2.5 一系列重组分泌表达菌株上清SDS-PAGE及分泌曲线分析
• 2.6 β-葡聚糖酶活力测定
• 3 结果与分析
• 3.1 突变体构建的PCR鉴定
• 3.2 突变体测序
• 3.3 含报告基因的信号肽突变重组表达质粒构建
• 3.4 信号肽N区带正电荷数对其分泌能力的影响
• 3.5 信号肽H区疏水性对其分泌能力的影响
• 3.6 筛选高分泌能力的突变信号肽
• 3.7 高分泌性表达菌株的分泌动态分析
• 4 讨论
• 第四章 对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白基因vp28的高效分泌表达及其分泌量动态分析
• 1 试验材料
• 1.1 宿主菌和载体
• 1.2 WSSV基因组
• 1.3 酶和试剂
• 1.4 培养基及主要化学试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 vp28基因扩增
• 2.2 重组表达载体pBES（H3N2）-VP28与pBES（H3N23）-VP28的构建与鉴定
• 2.3 B.subtilis WB600电击转化
• 2.4 B.subtilis WB600表达菌株的构建
• 2.5 Western blot检测
• 2.6 表达菌株分泌效率SDS-PAGE动态分析
• 3 结果与分析
• 3.1 vp28基因的克隆与序列分析
• 3.2 重组表达载体的鉴定
• 3.3 重组菌株上清SDS-PAGE检测与Western blot鉴定
• 3.4 表达菌株分泌量SDS-PAGE动态分析
• 4 讨论
• 第五章 抗WSSV囊膜蛋白VP28卵黄抗体的制备、提纯与稳定性研究
• 第一节 WSSV VP28的原核表达与纯化
• 1 试验材料
• 1.1 宿主菌和载体
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 主要化学试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 重组质粒pET-VP28的构建与转化
• 2.2 阳性表达子的筛选与鉴定
• 2.3 阳性表达子的诱导表达
• 2.4 重组VP28蛋白的纯化与SDS-PAGE检测
• 2.5 Bradford法测定纯化蛋白浓度
• 3 结果与分析
• 3.1 诱导表达产物SDS-PAGE检测
• 3.2 重组VP28蛋白纯化
• 3.3 纯化蛋白VP28浓度测定
• 4 讨论
• 第二节 抗WSSV VP28卵黄抗体的制备与提纯
• 1 试验材料
• 1.1 试验蛋鸡
• 1.2 抗原和试剂
• 1.3 主要化学试剂配制
• 2 试验方法
• 2.1 免疫方法和鸡蛋收集
• 2.2 IgY水稀释法粗提
• 2.3 间接ELISA抗体效价检测
• 2.4 IgY饱和硫酸铵纯化
• 2.5 冷冻干燥制备anti-VP28 IgY抗体粉
• 3 结果与分析
• 3.1 特异性IgY的抗体效价及其变化规律
• 3.2 IgY提纯SDS-PAGE检测
• 3.3 制备anti-VP28 IgY抗体粉
• 4 讨论
• 第三节 Anti-VP28 IgY的稳定性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 温度对IgY稳定性的影响
• 2.2 pH对IgY稳定性的影响
• 2.3 胃蛋白酶对IgY稳定性的影响
• 2.4 渗透压对IgY稳定性的影响
• 3 讨论
• 第六章 口服工程菌B.subtilis-VP28与特异性抗体VP28-IgY对螯虾体内保护效果及机理的研究
• 第一节 口服B.subtilis-VP28与VP28-IgY的抗病效果
• 1 试验材料
• 1.1 种毒与试验动物
• 1.2 工程菌与抗体
• 1.3 试验虾料
• 1.4 其它材料
• 1.5 培养基及主要化学试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 病毒增殖
• 2.2 WSSV分离纯化
• 2.3 WSSV电镜观察
• 2.4 病毒体内滴定
• 2.5 卵黄抗体VP28-IgY中和试验
• 2.6 芽孢形成及纯化
• 2.7 营养期B.subtilis-VP28制备
• 2.8 口服免疫试验
• 2.9 数据统计
• 3 结果与分析
• 3.1 病毒分离纯化
• 3.2 病毒感染浓度确定
• 3.3 VP28-IgY中和试验
• 3.4 B.subtilis-VP28的保护效果
• 3.5 VP28-IgY的保护效果
• 3.6 比较不同方式B.subtilis-VP28和VP28-IgY的保护效果
• 4 讨论
• 第二节 工程菌B.subtilis-VP28与抗体VP28-IgY免疫保护机理的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂
• 1.2 口服B.subtilis-VP28试验分组及血清采集
• 1.3 口服VP28-IgY试验分组及采样
• 1.4 血清酶活力及指标测定
• 1.5 光镜组织切片方法
• 1.6 JEM-1200EX型透射电镜制样方法
• 1.7 数据统计
• 2 结果与分析
• 2.1 B.subtilis-VP28对螯虾机体免疫防御能力的影响
• 2.2 VP28-IgY体内中和病毒的组织光镜观察
• 2.3 VP28-IgY体内中和病毒的组织电镜观察
• 2.4 B.subtilis-VP28和VP28-IgY组Caspase-3活力
• 3 讨论
• 3.1 B.subtilis-VP28对螯虾机体免疫因子的影响
• 3.2 B.subtilis-VP28对螯虾抗氧化功能及自由基代谢的影响
• 3.3 VP28-IgY体内中和病毒的组织修复
• 3.4 B.subtilis-VP28和VP28-IgY抑制WSSV引发的细胞凋亡
• 第七章 论文提示、创新点及后续研究展望
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表与录用的论文
• 致谢