大豆主要致敏原的免疫检测研究

论文摘要

通过切胶回收纯化获得纯度93%的大豆β-伴球蛋白α亚基,作为抗原制备出α亚基多克隆抗体PcAb-60K-A;用生物信息学方法对α亚基抗原表位进行预测,选取其特异的抗原表位85EQDERQFPFPR95作为半抗原,进行人工合成后,分别与载体蛋白KLH和BSA偶联作为免疫抗原和包被抗原,制备出α亚基特异多克隆抗体PcAb-60K-B和单克隆抗体McAb-60K（属于轻链为κ的IgG1,效价约为67,000）;PcAb-60K-A识别β-伴球蛋白α同时,还与α′亚基产生交叉反应,而PcAb-60K-B和McAb-60K能实现对α亚基的特异识别,而与包括β-伴球蛋白α′和β亚基在内的豆粕其他蛋白没有交叉反应;以McAb-60K和合成的包被抗原为工具,建立了定量检测大豆及豆粕中α亚基的竞争酶联免疫吸附法,该方法有效检测范围在0.65-29.84 ng/mL,IC50能达到4.42 ng/mL,具有较好的准确性和可重复性。人工合成大豆致敏蛋白P34的cDNA全长序列,通过原核表达系统pET-28a （+）和His亲和层析,获得纯度超过92%的P34融合蛋白;以P34融合蛋白为抗原成功制备出P34特异多克隆抗体PcAb-P34,效价能够达到729,000,并且与豆粕中其他蛋白没有交叉反应;用P34融合蛋白和PcAb-P34建立了大豆P34蛋白的间接酶联免疫吸附法,其标准曲线R2为0.9831,在一定范围内具有较高精密度和可重复性。人工合成大豆致敏蛋白Gly m Bd 28K的cDNA全长序列,通过原核表达系统pET28a-28a （+）,表达了Gly m Bd 28K融合蛋白,经His亲和层析,获得纯度超过90%的融合蛋白;以Gly m Bd 28K融合蛋白为抗原,制备出Gly m Bd 28K特异多克隆抗体PcAb-28K,效价能够达到27,000,并且与豆粕中其他蛋白没有交叉反应;以纯化的Gly m Bd 28K融合蛋白和PcAb-28K建立了大豆Gly m Bd 28K蛋白的间接酶联免疫吸附检测法,其标准曲线R2为0.9910,在一定范围内具有一定精密性和重复性。用本研究建立的免疫检测方法检测显示,α亚基、具致敏活性的P34和Gly m Bd 28K在大豆种子中含量分别为46.8μg/mg、4.62μg/mg和2.96μg/mg;在豆粕中分别为8.9μg/mg、3.91μg/mg和1.21μg/mg。经发酵处理的豆粕中α亚基、具致敏活性的P34和Gly m Bd 28K含量都被显著降低。酿酒酵母对α亚基分解效率最高,然后是产朊假丝酵母、扣囊拟内孢霉、白地霉和枯草芽孢杆菌;产朊假丝酵母和酿酒酵母对P34发酵脱敏效率最高,然后是扣囊拟内孢霉、白地霉和枯草芽孢杆菌,酿酒酵母、产朊假丝酵母和扣囊拟内孢霉发酵72 h豆粕中都未检出P34蛋白;产朊假丝酵母和酿酒酵母对Gly m Bd 28K脱敏效果最好,然后是扣囊拟内孢霉、白地霉和枯草芽孢杆菌,这5种菌发酵72 h豆粕中都未检出具致敏活性的Gly m Bd 28K。此外,本研究还用人工合成的大豆球蛋白A1a和A3酸性多肽基因序列,分别构建了原核表达载体pET30a-A1a和pET30a-A3,经0.8 mmol/L的IPTG诱导5 h,A1a和A3表达量最大;His亲和层析,获得了纯度达到90%的A1a融合蛋白和91%的A3融合蛋白,并且都具有免疫活性,为大豆球蛋白免疫检测方法的建立做好了准备,为从亚基水平上进一步研究大豆球蛋白致敏机理奠定了初步基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 大豆蛋白
• 1.2.1 大豆蛋白的分类
• 1.2.2 大豆蛋白的营养价值与应用
• 1.3 大豆致敏蛋白
• 1.3.1 β-伴球蛋白α亚基
• 1.3.2 P34/Gly m Bd 30K
• 1.3.3 Gly m Bd 28K
• 1.3.4 大豆球蛋白酸性多肽
• 1.3.5 其他致敏蛋白
• 1.4 大豆抗原蛋白与食物过敏
• 1.4.1 食物过敏
• 1.4.2 大豆致敏蛋白引起的过敏反应
• 1.4.3 大豆抗原蛋白脱敏处理
• 1.5 大豆抗原蛋白检测研究
• 1.5.1 免疫印记
• 1.5.2 酶联免疫吸附检测（ELISA）
• 1.5.3 免疫组织化学技术
• 1.5.4 聚合酶链式反应（PCR）
• 1.5.5 高效液相（HPLC）
• 1.6 大豆抗原蛋白抗体制备
• 1.6.1 过敏病人血清
• 1.6.2 过敏动物血清
• 1.6.3 重组表达抗原蛋白制备抗体
• 1.6.4 合成肽制备抗体
• 1.7 存在的问题、解决方案及技术路线
• 1.7.1 存在问题及解决方案
• 1.7.2 技术路线
• 第二章 β-伴球蛋白α亚基cELISA 检测方法建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 主要试剂和耗材
• 2.2.2 实验动物和植物材料
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 B 细胞表位预测软件
• 2.2.5 主要缓冲液配制
• 2.3 方法
• 2.3.1 蛋白提取
• 2.3.2 Bradford 法蛋白定量
• 2.3.3 β-伴球蛋白的α亚基切胶回收
• 2.3.4 免疫兔子
• 2.3.5 Western blotting
• 2.3.6 β-伴球蛋白的α亚基B 细胞表位预测
• 2.3.7 抗β-伴球蛋白α亚基PcAb 和McAb 制备
• 2.3.8 PcAb-60K-A、B 和McAb-60K 特异性分析
• 2.3.9 cELISA 检测方法的建立
• 2.3.10 β-伴球蛋白α亚基含量测定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 α亚基切胶纯化
• 2.4.2 α亚基B 细胞表位预测
• 2.4.3 抗原制备
• 2.4.4 PcAb-60K-A 和B 特异性
• 2.4.5 McAb 的制备
• 2.4.6 cELISA 检测方法
• 2.4.7 大豆和豆粕中 β-伴球蛋白 α 亚基含量检测
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 第三章 P34 蛋白iELISA 检测方法建立
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 主要试剂和耗材
• 3.2.2 实验动物和植物材料
• 3.2.3 质粒和菌株
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 培养基和主要缓冲液配制
• 3.3 方法
• 3.3.1 P34 基因和引物合成
• 3.3.2 E.coli 感受态制备
• 3.3.3 P34 原核表达载体构建
• 3.3.4 重组P34 蛋白的原核表达
• 3.3.5 PcAb 制备
• 3.3.6 Western blotting 检测
• 3.3.7 iELISA 检测方法的建立
• 3.3.8 P34 蛋白含量测定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 P34 基因合成
• 3.4.2 P34 原核表达载体构建
• 3.4.3 P34 融合蛋白的原核表达
• 3.4.4 P34 融合蛋白的纯化
• 3.4.5 PcAb 制备
• 3.4.6 Western blotting 检测
• 3.4.7 iELISA 检测方法
• 3.4.8 P34 蛋白含量
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 第四章 Gly m Bd 28K 蛋白iELISA 检测方法建立
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.3 方法
• 4.3.1 Gly m Bd 28K 基因和引物合成
• 4.3.2 Gly m Bd 28K 原核表达载体构建
• 4.3.3 重组Gly m Bd 28K 蛋白的原核表达
• 4.3.4 PcAb 制备和效价测定
• 4.3.5 Western blotting 检测
• 4.3.6 iELISA 检测方法的建立
• 4.3.7 Gly m Bd 28K 蛋白含量测定
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 Gly m Bd 28K 基因合成
• 4.4.2 Gly m Bd 28K 原核表达载体构建
• 4.4.3 Gly m Bd 28K 融合蛋白的原核表达
• 4.4.4 PcAb 制备
• 4.4.5 Western blotting 检测
• 4.4.6 iELISA 检测方法
• 4.4.7 Gly m Bd 28K 蛋白含量
• 4.5 讨论
• 4.6 小结
• 第五章 大豆球蛋白酸性多肽分析和表达
• 5.1 引言
• 5.2 材料
• 5.2.1 质粒和菌株
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 分析软件
• 5.3 方法
• 5.3.1 11S 球蛋白酸性多肽序列分析
• 5.3.2 基因和引物合成
• 5.3.3 原核表达载体构建
• 5.3.4 重组蛋白的原核表达
• 5.3.5 Western blotting 检测
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 11S 球蛋白酸性多肽同源性分析
• 5.4.2 基因合成
• 5.4.3 原核表达载体构建
• 5.4.4 重组蛋白的原核表达
• 5.4.5 Western blotting 检测
• 5.5 讨论
• 5.6 小结
• 第六章 结论
• 1.本研究的主要结论
• 2.本研究主要创新点
• 3.后续工作设想
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历