番茄Aux/IAA基因的克隆与功能分析

论文摘要

生长素是一类重要的植物激素，它与植物生长发育的许多过程相关。在细胞水平上，生长素影响细胞的伸长、分裂和分化。在个体水平上，生长素在植物的顶端优势、侧根／不定根的形成、植物的向性反应、果实的座果和发育、维管组织的分化和胚的形成等方面是都是必需的。由于生长素具有这些多样化的调节活性，因此，生长素、生长素反应以及生长素信号转导引起了人们极大的兴趣。已有的研究成果表明，尽管生长素可以通过直接影响细胞膜和细胞骨架的功能来调节一些细胞反应，但生长素更多是通过调控基因表达来影响植物的发育和其他的一些反应。Aux／IAA、SAUR和GH3等是三类主要的生长素早期诱导表达的基因，生长素能够诱导这三类基因中的多数基因快速、特异、并且在不需要新的蛋白质生物合成的条件下表达，这些基因也被认为是生长素诱导的原初表达基因。在这三类基因中，Aux／IAA基因家族的研究相对较多。 以拟南芥为模式植物的植物生物化学、分子生物学和遗传学的研究也已经证实Aux／IAA蛋白在生长素的信号转导和植物的生长发育中起着重要的作用。拟南芥Aux／IAA基因突变体表现出与生长素直接相关的发育表型的改变，包括改变植株的向光性、向地性、顶端优势、根的形成、茎／下胚轴的伸长、叶片的展开以及黑暗条件下叶片的形成等。在氨基酸序列上，番茄Aux／IAA蛋白与拟南芥Aux／IAA蛋白有比较大的差异，且番茄果实为鲜果，生理学的研究表明生长素与番茄果实的座果、膨大和成熟等有着密切的关系，外源生长素能促进番茄果实的单性结实，因此以番茄为模式植物研究生长素信号转导相关的Aux／IAA基因的生物学功能，对全面了解生长素在植物根、茎、叶、花、果等的生长、发育以及形态建成过程中所发挥的作用，揭示番茄单性结实可能的分子机理，阐明生长素信号转导的复杂分子机制具有重要的理论意义。对番茄生产中合理利用生长素、生长素类似物以及生长素转运抑制物等调控番茄植株的生长发育、果实的座果、果实的发育成熟等也具有实际的指导意义。 本研究的目的：比较全面的分析番茄Aux／IAA基因的进化和组织／器官表达情况，初步预测这些基因可能的功能；利用转基因手段分析三个Aux／IAA基因，即SlIAA3，SlIAA4和SlIAA14，在番茄生长和发育过程中的生物学功能，从分子水平初步阐明它们可能的作用机制；初步分析这三个基因在生长素效应中发挥的作用，创建一些应用于生长素信号转导研究的材料；创造一些单性结实的材料，应用于果实单性结实分子机理的研究。本研究中主要涉及到生物信息学和植物转基因研究，获得的主

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 前人研究工作
• 1.2.1 生长素生物活性的分析及其复杂性
• 1.2.2 生长素信号转导
• 1.2.2.1 生长素调节基因的表达
• 1.2.2.2 ARF介导的生长素诱导基因表达的改变
• 1.2.2.3 Aux／IAA蛋白阻遏ARF的功能
• TIR1泛素连接酶介导Aux／IAA蛋白的降解'>1.2.2.4 SCF^TIR1泛素连接酶介导Aux／IAA蛋白的降解
• 1.2.2.5 TIR1是一个生长素受体蛋白
• 1.3 基因定位分析
• 1.4 本研究的目的和内容
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株、质粒及试剂
• 2.3 番茄Aux／IAA基因家族分析
• 2.4 基因组织／器官特异性表达分析
• 2.5 番茄8个Aux／IAA基因的RACE扩增
• 2.5.1 RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）引物
• 2.5.2 RACE扩增
• 2.6 基因定位分析
• 2.7 植物表达载体构建
• 2.7.1 RT-PCR／PCR扩增全长cDNA／gDNA
• 2.7.2 全长cDNA／gDNA序列分析
• 2.7.3 Sense和Antisense植物表达载体构建
• 2.7.4 RNAi植物表达载体的构建
• 2.8 番茄的遗传转化
• 2.9 转基因番茄植株的分子分析
• 2.9.1 番茄转化再生植株的PCR分析
• 2.9.2 转基因番茄植株的Southern杂交分析
• 2.10 番茄entire突变体SlIAA4基因的分析
• 2.11 番茄幼苗黄化和IAA诱导处理
• 2.12 种子发芽实验
• 2.13 幼苗水培研究
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄Aux／IAA基因生物信息学分析
• 3.2 番茄Aux／IAA基因在不同组织的表达分析
• 3.3 番茄Aux／IAA基因的克隆
• 3.3.1 SlIAA3（TC156698）基因的克隆与序列分析
• 3.3.2 SlIAA4（TC162280）基因的克隆与序列分析
• 3.3.3 SlIAA14（TC163401）基因的克隆与序列分析
• 3.4 番茄Aux／IAA基因多态性与拷贝数分析
• 3.4.1 SlIAA3基因组拷贝数与多态性分析
• 3.4.2 SlIAA4基因组拷贝数与多态性分析
• 3.4.3 SlIAA14基因组拷贝数与多态性分析
• 3.5 SlIAA3和SlIAA4基因的定位分析
• 3.5.1 SlIAA3基因的定位分析
• 3.5.2 SlIAA4基因的定位分析
• 3.6 植物遗传转化载体的构建
• 3.6.1 超量表达和反义抑制植物遗传转化载体的构建
• 3.6.1.1 SlIAA3基因超量表达和反义抑制植物遗传转化载体的构建
• 3.6.1.2 SlIAA4基因超量表达和反义抑制植物遗传转化载体的构建
• 3.6.1.3 SlIAA14基因超量表达和反义抑制植物遗传转化载体的构建
• 3.6.2 RNAi植物遗传转化载体的构建
• 3.7 转基因植株的获得
• 3.8 转基因番茄植株的分子分析
• 3.8.1 SlIAA3转基因植株的PCR分析
• 3.8.2 SlIAA4转基因植株的PCR分析
• 3.8.3 SlIAA14转基因植株的PCR分析
• 3.8.4 转基因植株的Southern杂交分析
• 3.9 转基因番茄植株生长发育变化的初步观察
• 3.9.1 SlIAA3基因影响番茄主根的形态建成
• 3.9.2 SlIAA4基因引起番茄多效性的表型
• 3.9.2.1 SlIAA4基因影响番茄叶片的形态建成
• 3.9.2.2 SlIAA4基因影响番茄开花
• 3.9.3 SlIAA14基因影响番茄主侧根的形态建成
• 3.10 番茄entire突变体SlIAA4基因的分析
• 4 讨论
• 4.1 生物信息学与番茄基因克隆
• 4.2 激素类相关基因遗传转化问题的探讨
• 4.3 番茄叶片的形态建成与SlIAA4基因的功能
• 4.4 番茄根的形态建成与SlIAA3、SlIAA14基因的功能
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录一：植物DNA的小量法提取程序
• 附录二：Trizol一步法提取植物总RNA方法
• 附录三：质粒的小量提取方法
• 附录四：Southern Blot程序
• 附录五：研究生期间已发表或接受的论文及会议论文摘要