恶性肿瘤个体化治疗相关生物标志物的筛选研究

论文摘要

恶性肿瘤是威胁人类健康的常见疾病,位居人类疾病三大主要死亡原因之首,占所有疾病死因的四分之一。多年来,恶性肿瘤的治疗手段保持着以手术为主辅以全身的化疗和局部放疗的综合治疗模式；近年来,肿瘤学家认识到由于个体肿瘤的生物遗传异质性以及个体间的遗传差异性决定了不同患者对同一肿瘤治疗方案表现不同的反应性。对这些差异的理解使我们在肿瘤治疗策略上产生革命性的变化即肿瘤的个体化治疗,肿瘤个体化治疗是对每一个肿瘤患者“量体裁衣”,根据每个个体肿瘤生物学特征以及基因组学和转录组学上的差异进行针对性的治疗,使疗效最大化和毒性最低化。恶性肿瘤药物治疗包括化学治疗和靶向治疗。传统的肿瘤化学治疗存在治疗的靶向不明确、选择性不强和易产生耐药等特点,导致其有效率低和在杀伤肿瘤细胞的同时损害正常组织细胞等缺点,然而如何实现传统化疗对肿瘤患者的个体化治疗是目前肿瘤学家需要深入研究的问题,目前在一些恶性肿瘤的化疗中已经发现一些基因的多态性和表达状况与某些化疗药物的疗效以及副反应有一定的相关性,可以用来指导化疗药物的选择。随着对肿瘤发生发展分子机制认识的不断深入和分子生物学技术的发展,针对肿瘤细胞受体、信号传导和血管生成等关键分子的分子靶向治疗已成为肿瘤药物治疗领域的一个新的方向,是肿瘤个体化治疗理念的一个重要典范。靶向治疗是指抗肿瘤药物靶向性地与肿瘤的不同特性靶标位点发生作用而杀死肿瘤细胞,靶向治疗对正常组织影响较小,是目前最理想的肿瘤治疗模式。因此在本研究中,我们以我国常见的两种恶性肿瘤,结直肠癌和肺癌为例,应用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱（Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, SELDI-TOF-MS）蛋白质指纹图谱分析技术,在血清中寻找可以预测两种肿瘤常用化疗药物疗效的蛋白标志物；在结直肠癌组织标本中,应用焦磷酸盐测序法分析抗EGFR单克隆抗体靶向治疗分子标志K-ras基因的突变状况及其与临床病理因素的相关性。第一部分晚期结直肠癌化疗疗效预测的血清蛋白质指纹图谱模型的初步研究1、应用SELDI-TOF-MS蛋白质学技术,分析晚期结直肠癌患者42例化疗受益者与28例无效者血清蛋白质指纹图谱差异,筛选出10个蛋白质峰（质荷比为9286m/z、9431m/z、9375m/z、9298m/z、4304m/z,9352m/z,9404m/z,4606m/z, 9198m/z,3963m/z）组合所构建而成的结直肠癌化疗疗效预测模型,其总准确率为90.0%（63/70）,灵敏度为90.7%（39/43）,特异度为88.9%（24/27）这些蛋白质峰均在化疗受益组表达高于化疗无效组。2、应用SELDI-TOF-MS蛋白质学技术,分析29例接受FOLFOX化疗方案受益者与15例无效者血清蛋白质指纹图谱差异,筛选出6个蛋白质峰（质荷比为9298m/z、9282m/z、4606m/z、9198m/z、7775m/z,2266m/z）组合所构建而成的FOLFOX方案化疗的化疗疗效预测模型总准确率为88.6%（39/44）,灵敏度为92.9%（26/28）,特异度为81.3%（13/16）。其中2266m/z这个峰在化疗受益者中低表达；9298 m/z、9281 m/z、4606m/z、9198m/z、7775m/z这5个峰在化疗受益者中高表达。3、应用SELDI-TOF-MS蛋白质学技术,分析13例接受FOLFIRI方案化疗受益者与13例无效者血清蛋白质指纹图谱差异,筛选出7个蛋白质峰（质荷比为4321m/z、4305m/z、2648m/z、2952m/z、4121m/z,4292m/z,3980 m/z）组合所构建而成的结直肠癌FOLFIRI方案化疗的疗效预测模型总准确率为92.3%（24/26）,灵敏度为92.3%（12/13）,特异性为92.3%（12/13）。其中2648m/z,2952m/z,4121m/z这3个峰在化疗受益者中低表达,4321 m/z、4305 m/z、4292 m/z、3980m/z这3个峰在化疗受益者中高表达。第二部分晚期非小细胞肺癌化疗疗效预测的血清蛋白质指纹图谱模型的初步研究通过对晚期非小细胞肺癌患者中35例化疗受益者与12例无效者血清蛋白质质谱数据的比较,共检测到表达差异有统计学意义（P<0.05）的蛋白质峰11个通过交叉验证,判别分析软件筛选出8个蛋白质峰（质荷比为4353m/z、2970m/z、2957m/z、4292m/z、3943m/z,2961m/z,4121m/z,2000m/z）组合所构建而成的NSCLC化疗疗效预测模型的准确率为95.7%。其中4353m/z、2970 m/z、2957 m/z、4292 m/z、3943 m/z、2961 m/z、4121 m/z这7个峰在晚期非小细胞肺癌患者化疗受益者血清中表达高于无效者；2000m/z这个峰在非小细胞肺癌患者化疗受益者血清中表达低于无效者。第三部分K-ras和BRAF基因突变及其与结直肠癌临床病理因素的关系研究选取118例均经病理证实的结直肠癌肿瘤组织标本。焦磷酸盐测序法检测K-ras基因第1外显子第12、13和61密码子以及BRAF基因第600密码子突变状况,并分析K-ras基因突变与病人年龄、肿瘤部位、分化程度、临床分期、pT及pN以及预后的相关性。1、在40例结直肠癌标本中,分别应用PCR-直接测序法和焦磷酸盐测序法检测K-ras基因第1外显子第12和13密码子突变,比较两种方法的检出率、灵敏度,40例结直肠癌患者的肿瘤组织经常规PCR扩增后直接测序无一例发现K-ras基因第12、13密码子的突变；经焦磷酸测序法检测发现,11例含有K-ras基因第12密码子突变,2例含有K-ras基因第13密码子突变,总突变检测率32.5%（13/40）。2、118例结直肠癌组织标本经焦磷酸盐测序法检测共发现突变41例,突变率为34.7%（41/118）,其中第12密码子突变28例,突变率为23.7%（28/118）；第13密码子突变12例,突变率为10.2%（12/118）；第61密码子突变仅1例（0.8%,1/118）；仅有2个患者被检测到15外显子的第600密码子的BRAF基因突变。3、K-ras突变与性别存在显著的相关性,女性结直肠癌病人组织中K-ras基因突变明显高于男性（44.7% vs 28.2%,P=0.037）,女性直肠癌患者组织中K-ras基因突变率高于男性（34.0% vs 11.2%,P<0.05）,而男性结肠癌患者组织中K-ras基因突变率则高于女性（16.9% vs 10.6%,P<0.05）。4、野生型K-ras结直肠癌患者的中位生存时间为84.0个月,较突变型K-ras患者的中位生存期（63.0月）要稍高,然而差异不显著（P=0.25）; K-ras第12、13密码子突变患者的中位生存期分别为45.0月和63.0月；而第61密码子突变患者的中位生存期则较长,为73.0月,然而没有数据表明K-ras基因第12、13和61密码子突变与患者生存期之间存在显著的相关性。结论1、10个蛋白质峰（质荷比为9286m/z、9431m/z、9375m/z、9298m/z、4304m/z,9352m/z, 9404m/z,4606m/z,9198m/z,3963m/z）组合所构建而成的模型可以预测晚期结直肠癌化疗疗效,其准确率为90.0%；2、6个蛋白质峰（质荷比为9298m/z、9282m/z、4606m/z、9198m/z、7775m/z, 2266m/z）组合所构建而成的模型可以预测晚期结直肠癌FOLFOX方案的化疗疗效,准确率为88.6%；3、7个蛋白质峰（质荷比为4321m/z、4305m/z、2648m/z、2952m/z、4121m/z, 4292m/z,3980 m/z）组合所构建而成的模型可以预测晚期结直肠癌FOLFIRI化疗方案的疗效,准确率为92.3%；4、8个蛋白质峰（质荷比为4353m/z、2970m/z、2957m7z、4292m/z、3943m/z, 2961m/z,4121m/z,2000m/z）组合所构建而成的晚期NSCLC化疗疗效预测模型的准确率为95.7%；5、与目前临床基因突变检测的经典方法--PCR产物直接测序方法相比,焦磷酸盐测序法能快捷、灵敏地检测出结直肠癌组织中K-ras基因的突变,可作为K-ras基因临床常规突变检测方法推广；6、在中国人群中,K-ras基因突变在结直肠癌病人中常见,其突变与性别有相关性,女性患者者较男性病突变率更高；K-ras基因突变不是结直肠癌的独立预后因子；BRAF基因突变发生率低。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语
• 目次
• 引言
• 第一部分 血清蛋白质指纹图谱在晚期结直肠癌化疗疗效预测中的初步研究
• 前言
• 1 血清蛋白质指纹图谱在晚期结直肠癌化疗疗效预测中的研究
• 2 血清蛋白质指纹图谱在晚期结直肠癌不同化疗方案疗效预测中的研究
• 讨论
• 结论
• 第二部分 血清蛋白质指纹图谱在晚期非小细胞肺癌化疗疗效预测中的初步研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 第三部分 K-ras和BRAF基因突变及其与结直肠癌临床病理因素的相关性研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 研究结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简历及在学期间主持课题和发表论文