论文摘要
近年来艾滋病毒,即人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）在世界范围内迅速传播,尤其是在非洲,已经成为死亡的首要病因。联合国艾滋病规划署和世界卫生组织2006年11月21日共同发布的《2006年世界艾滋病报告》显示,2006年全球新增艾滋病病毒感染者430万,使艾滋病病毒感染者总数达3,950万,同时全球又有290万人死于艾滋病。截至2006年10月31日,我国历年累计报告HIV感染者183,733例,其中艾滋病病人40,667例,死亡12,464例。国际医学界至今尚无治愈艾滋病的有效药物和疗法。因而研制针对我国HIV流行株的预防性和治疗性疫苗迫在眉睫。目前研制的预防性疫苗还不能产生针对HIV的持久免疫力,本研究的目的是构建有效抑制HIV复制的治疗性疫苗,有效后再用于预防。在经过抗逆转录病毒药物治疗、病人血浆HIV病毒载量下降后,应用该疫苗替代或减少化学药物的应用,从而达到抑制病毒复制、减轻病情的作用。本研究首先比较HIV-1 gag基因野生型（wt.gag）与密码子优化型（mod.gag）在体外细胞水平表达量,经Western Blot证实mod.gag基因的表达水平明显高于wt.gag基因。因此后续实验均采用mod.gag构建的重组病毒株。经PCR,Western Blot,间接免疫荧光鉴定了密码子优化过的HIV-1 gag基因在重组腺病毒（rAd5/F35-mod.gag）的正确插入和体外细胞水平的表达;用rAd5/F35-mod.gag以不同的方式单独或与DNA,rAAV2/1联合免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠血清中的P24特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答。结果重组腺病毒rAd5/F35-mod.gag中gag正确插入并且在体外细胞水平可以很好的表达目的基因gag;除PBS对照组外,在小鼠体内rAd5/F35-mod.gag单独或与DNA联合免疫均可诱导特异性的CTL应答和血清IgG抗体反应,单独免疫rAd5/F35-mod.gag两次分泌IFN-γ的CD8+ T细胞占总CD8+T细胞的8.828±1.554%,该组CTL反应的效果优于DNA初免,rAd5/F35-mod.gag加强的联合免疫组（3.62±2.03%）。单独免疫rAd5/F35-mod.gag组抗HIV-1 P24 IgG抗体滴度为1:12800,高于其他各组,反应结果与细胞免疫反应结果一致。腺病毒5型（Ad5）在人群中的感染率较高,预先存在的抗体可能会降低腺病毒载体携带的目的基因在体内的表达水平从而减弱其免疫原性。本研究通过改变Ad5型的纤突蛋白Fiber构建了含有gag基因的rAd5/F35-mod.gag载体,期望可以避免Ad5特异性免疫反应的抑制作用。首先用Ad5-GFP免疫小鼠来诱导针对Ad5的特异性免疫反应,再用rAd5/F35-mod.gag和rAd5-mod.gag免疫小鼠,检测HIV-1 Gag特异性的细胞免疫反应。Ad5-GFP初次感染4周后,rAd5/F35-mod.gag免疫2次后分泌IFN-γ的CD8+ T细胞占总CD8+T细胞的1.71±0.05%,低于rAd5/F35-mod.gag单独免疫2次的特异性细胞免疫水平（4.34±3.27%）;而rAd5 -mod.gag在预先存在Ad5特异性免疫反应影响下,HIV特异性细胞免疫水平0.75±0.06%,远低于rAd5-mod.gag单独免疫2次的细胞免疫水平（4.70±0.73%）。因此rAd35/F35受到预先存在Ad5特异性免疫反应的抑制作用相对较小。因此重组腺病毒rAd5/F35-mod.gag只改变Ad5纤突蛋白Fiber,可以部分避免Ad5特异性免疫反应的抑制作用。上述结果表明rAd5/F35-mod.gag载体用做疫苗可诱导强而持久的HIV-1特异性细胞及体液免疫反应,是一种有希望的HIV候选疫苗。
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