论文摘要
聚β-基丁酸酯（PHB）为微生物在不平衡生长条件下于细胞内合成的一类贮藏性聚酯,广泛存在于自然界原核生物中。因其不仅具有与化学合成高分子相似的性质,而且,其良好的生物相容性、生物降解性、光学活性和压电性等独特的性质使得PHB可以作为包装材料、光学材料和医用材料等取代通用的塑料而得到多方面的应用。本实验是在对PHB解聚酶降解行为充分研究的基础上,优化发酵生产和分离纯化途径,对Penicillium sp. DS9713a菌株产生的胞外聚β-羟基丁酸酯（PHB）解聚酶进行提纯,并对其酶学性质及蛋白质学性质进行了初步研究。主要实验结果如下:1、以青霉（Penicillium sp.）,编号DS9713a为实验菌株,采用传统摇瓶培养和发酵罐发酵生产胞外PHB解聚酶。产酶高峰分别出现在96h和72h。对发酵液按以下流程进行分离纯化:发酵液处理--->超滤浓缩（截留分子量5000）--->（NH4）2SO4沉淀除杂（40%饱和度）--->分级透析--->冷冻干燥---> Sepharose CL-6B凝胶色谱。经检测纯化后的PHB解聚酶,纯化倍数为59.1,总酶活回收率为20%。2、酶蛋白基本性质:采用高效液相色谱对酶蛋白单一性进行检测,结果显示样品纯度较好;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一谱带,依据PHB解聚酶的Rm求得其分子量为18 000Da;采用连续聚丙烯酰胺等电聚焦电泳等电点pI为7.6;最适pH为8.6;化学试剂EDTA对PHB解聚酶抑制率最强,SDS,巯基乙醇使酶活损失较大,H2O2,尿素对酶活抑制不明显。3、PHB解聚酶蛋白质学研究:Agilent1100型氨基酸自动分析仪分析样品氨基酸组分,结果显示,DS9713a菌株所产生的PHB解聚酶除Met外含有15种常见氨基酸,其中天冬氨酸和谷氨酸含量较高,其侧链基团可能在底物结合或酶的催化反应中起作用;圆二色谱分析显示酶蛋白二级结构为:Helix:47.5%,Turn:24.3%, Random:28.2%;以PHB为底物,对降解产物进行质谱检测,结果降解产物为3HB单体。
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