高产AmpC酶和ESBLs酶阴沟肠杆菌多重耐药分子机制的研究

论文摘要

【目的】了解同时高产AmpC酶和/或ESBLs酶的阴沟肠杆菌对临床常用抗菌药物的耐药表型和耐药模式,以及对β-内酰胺类以外抗生素的耐药机制。【方法】（1）采用琼脂平皿二倍稀释法测定14株同时高产AmpC酶和ESBLs酶的阴沟肠杆菌对21种抗生素的耐药表型（MIC）。（2）应用聚合酶链反应（PCR）对14株同时高产AmpC酶和ESBLs酶的阴沟肠杆菌gyrA及parC基因进行扩增、测序并与野生型大肠杆菌相对应的gyrA及parC基因QNDR核苷酸序列进行比较分析。（3）采用PCR对25株产ESBLs酶的阴沟肠杆菌进行qnrA、qnrB、qnrS和aac（6’）-Ib-cr基因的扩增和测序。（4）采用PCR方法对14株同时高产AmpC酶和ESBL酶的阴沟肠杆菌3类整合酶基因进行扩增和测序,对整合子可变区进行扩增和测序。（5）采用PCR方法对14株同时高产AmpC和ESBLs酶的阴沟肠杆菌进行AMEs和16S rRNA甲基化酶基因检测。【结果】（1）对14株同时高产AmpC酶和ESBLs的阴沟肠杆菌,碳青霉烯类抗菌活性最强,敏感率100%,氨苄西林/舒巴坦、头孢西丁、第三代头孢菌素和氨曲南耐药率均为100%,哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦和头孢吡肟敏感率均为0%,耐药率（不包括“中敏”-Ⅰ）分别为50%、85.71%、85.71%,氨基糖甙类和喹诺酮类敏感率在12.50-25%之间。85.71%的上述阴沟肠杆菌表现为多重耐药,对3-5组抗菌药物耐药。（2）14株高产AmpC酶和ESBLs酶的阴沟肠杆菌gyrA基因和parC基因喹诺酮耐药决定区扩增和序列分析结果表明:78.58%（11/14）菌株gyrA基因在83位氨基酸（TCC→TTC,Ser→Phe）和87位氨基酸密码子（GAC→GCC,Asp→Ala）发生了改变,7.14%（1/14）菌株83位氨基酸密码子发生了改变（TCC→TAC,Ser→Tyr）,71.43%（10/14）阴沟肠杆菌ParC蛋白80位氨基酸密码子发生了突变（AGC→ATC,Ser→Ile）,71.4%（10/14）菌株GyrA和Parc蛋白均存在氨基酸改变,12株喹诺酮类耐药菌株在GyrA、ParC蛋白的QRDR有1-3个氨基酸改变,2株敏感阴沟肠杆菌没有氨基酸改变。（3）25株产ESBLs酶阴沟肠杆菌qnrA基因阳性率4%,qnrB2基因阳性率16%,与阴沟肠杆菌（登录号EU131184）qnrB2基因核苷酸序列同源性为86%,有6个氨基酸发生了改变,没有发现qnrS基因和aac（6’）-Ib-cr基因,100%qnr基因阳性阴沟肠杆菌均产SHV-12型ESBLs。80%（4/5）qnr基因阳性阴沟肠杆菌对环丙沙星、左旋氧氟沙星、氧氟沙星和加替沙星表现为敏感,20%（1/5）表现为敏感性下降,5株qnr阳性阴沟肠杆菌gyrA和parC基因没有发生突变。（4）aac（6’）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、ant（3’）-Ⅰ和ant（2’）-Ⅰ基因扩增阳性率分别为85.71%、21.43%、78.57%和14.29%,没有发现aac（6’）-Ⅱ、aac（3）-Ⅰ和aph（3″）-Ⅵ基因。16s rRNA甲基化酶armA基因阳性率为78.57%（11/14）,其中90.90%（10/11）阴沟肠杆菌产CTX-M-3型ESBLs,9.1%的阴沟肠杆菌产SHV-12型ESBLs,没有发现rmtB和rmtC基因。16S rRNA甲基化酶armA基因阳性阴沟肠杆菌对庆大霉素、丁胺卡那、妥布霉素和奈替米星均表现出高水平耐药（MICs＞256μg/ml）。（5）85.71%（12/14）高产AmpC和ESBLs酶阴沟肠杆菌含有Ⅰ类整合子,没有检测到Ⅱ和Ⅲ类整合子。78.57%（11/14）菌株Ⅰ类整合子可变区扩增阳性。最常见的是编码对氨基糖甙类耐药基因盒aadA和甲氧氨胺嘧啶耐药基因盒dfrA。扩增子为2121bp的1株菌含有2个基因盒dfrA12-aadA2,dfrA12编码二氢叶酸还原酶12,对甲氧苄氨嘧啶耐药,aadA2编码氨基糖甙腺苷转移酶A2,对链霉素和大观霉素耐药,其中dfrA12和dfrA12-aadA2基因盒排列首次在阴沟肠杆菌中发现。扩增子为1865bp的1株菌含有2个基因盒dfrA17-aadA5;扩增子为1776bp的1株菌含有2个基因盒dfrA16-aadA2;扩增子为1236bp的1株菌含基因盒aadA4,其中aadA4是首次在阴沟肠杆菌中发现的。6株扩增子为1194bp的阴沟肠杆菌含基因盒aadA2;扩增子为962bp的1菌株含基因盒aadB,编码氨基糖甙（2”）-O-腺苷酰基转移酶,对妥布霉素、庆大霉素和卡那霉素耐药。【结论】（1）同时高产AmpC酶和ESBLs酶的阴沟肠杆菌,绝大多数为多重耐药菌株,碳青霉烯类体外抗菌活性最强,第三代头孢菌素、第四代头孢菌素和β-内酰胺类/酶抑制剂1 00%不敏感,氨基糖甙类和喹诺酮类仅对少数菌株（10.25%-25%）敏感。（2）阴沟肠杆菌DNA旋转酶亚单位GyrA 83位氨基酸Ser、87位氨基酸Asp改变是对喹诺酮类耐药的主要机制,单个Ser→83氨基酸改变就可以引起对氟喹诺酮耐药。（3）产ESBLs酶的阴沟肠杆菌qnr基因的流行率为20%,100%qnr基因阳性菌株与SHV-12型ESBLs相关联。qnr基因阳性阴沟肠杆菌对喹诺酮类表现敏感或仅为敏感性下降,qnr阳性菌株gyrA和parC基因QRDR核苷酸序列没有发生基因突变。（4）产氨基糖甙类修饰酶aac（6’）-Ⅰ、aac（3）-Ⅱ、ant（3’）-Ⅰ、ant（2’）-Ⅰ和16S rRNA甲基化酶armA是阴沟肠杆菌耐氨基糖甙类的主要机制,16S rRNA甲基化酶armA基因阳性菌株对庆大霉素、丁胺卡那、妥布霉素和奈替米星均表现出高水平的耐药（MICs＞256ug/ml）。16S rRNA甲基化酶armA基因与CTX-M-3型和SHV-12型ESBLs相关联。（5）Ⅰ类整合子在阴沟肠杆菌耐药基因传播中起主导地位,最常见的耐药基因型是编码对氨基糖甙类耐药的基因盒（aadA2、aadA4和aadA5）和对甲氧氨胺嘧啶耐药的基因盒dfrA（dfrA12、drfA16和dfrA17）。

论文目录

• 缩略语
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 临床分离14株高产AmpC酶和ESBLs酶的阴沟肠杆菌耐药表型
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第二部分 高产AmpC酶和ESBLs阴沟肠杆菌对喹诺酮类耐药机制
• 第一节 阴沟肠杆菌gyrA基因和parC基因突变及其与喹诺酮类耐药表型的相关性研究
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第二节 阴沟肠杆菌对喹诺酮类耐药质粒介导机制研究
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第三部分 高产AmpC酶和ESBLs酶阴沟肠杆菌对氨基糖甙类药物机制
• 第一节 氨基糖甙类修饰酶和16SrRNA甲基化酶与阴沟肠杆菌对氨基糖甙类耐药表型的相关性研究
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 第二节 阴沟肠杆菌整合子可变区耐药基因盒分析及其与氨基糖甙类耐药表型的相关性研
• 一、材料和方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一:阴沟肠杆菌耐药机制的最新研究进展
• 综述二:难治性真菌感染抗真菌药物联合治疗的研究进展
• 攻读学位期间发表论文情况
• 致谢