藤黄灰链霉菌合成麦拓莱霉素的PKS基因克隆和功能分析

论文摘要

麦拓莱霉素是由藤黄灰链霉菌产生一种结构全新、抑菌效果明显的新型抗生素,具有很高的研究开发价值。寻找麦拓莱霉素的生物合成相关基因对确定该抗生素代谢途径、提高生产能力等具有重要意义。本实验室的前期研究表明麦拓莱霉素的生物合成可能涉及聚酮合成途径,本文试图通过同源克隆策略,根据已知大环内酯类抗生素的生物合成基因信息,采用PCR方法从藤黄灰链霉菌中克隆麦拓莱霉素的生物合成基因,并构建基因失活突变株,研究基因的功能。在对PCR循环参数优化的基础上,从藤黄灰链霉菌中依次克隆得到三个基因片段,总长度3659 bp,该基因簇命名为mai-PKS。对mai-PKS的序列分析表明,它包括4个基因,按照基因的排列次序分别命名为mai-MT、mai-KS1、mai-ACP和mai-KS2。Mai-MT基因长906 bp,编码301个氨基酸。Mai-KS1基因长1047bp,编码348个氨基酸。Mai-ACP基因长249 bp,编码82个氨基酸。Mai-KS2基因长1341 bp,编码447个氨基酸。Blast和Cluster分析显示,mai-MT基因的氨基酸序列与其他微生物的丙酰基ACP转移酶具有高度同源性,同源性为60%～80%。mai-KS1基因的氨基酸序列与其他微生物的3-氧酰基ACP合成酶具有高度同源性,同源性为65%～92%。mai-ACP基因的氨基酸序列与其他微生物的酰基载体蛋白具有高度同源性,同源性为68%～92%。mai-KS2基因的氨基酸序列与其他微生物的β-酮酰基合成酶的具有高度同源性,同源性为62%～90%。该基因簇中基因的排序与聚酮合成基因簇类似, 4个基因与阿维链霉菌具有最大同源性。利用mai-KS2基因,通过同源交换方法,构建了mai-KS2基因失活的阻断突变株。用液质连用技术检测次生代谢产物的合成,结果表明阻断突变株已不能合成麦拓莱霉素。基因mai-KS2乃至mai-PKS是与麦拓莱霉素生物合成相关的。本文首次从藤黄灰链霉菌中采用PCR扩增的方法克隆到与麦拓莱霉素生物合成相关的基因,确定了麦拓莱霉素的聚酮合成途径,为进一步研究该抗生素全生物合成基因和藤黄灰链霉菌的分子工程、新型杂合抗生素的组合生物合成奠定前期基础。

论文目录

• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 抗生素的发展
• 1.2 链霉菌抗生素生物合成基因的研究
• 1.2.1 抗生素合成相关基因的克隆方法
• 1.2.2 聚酮合成基因簇的研究
• 1.2.2.1 聚酮合成酶
• 1.2.2.2 红霉素生物合成基因簇
• 1.2.2.3 苦霉素生物合成基因簇
• 1.3 本文的研究意义和主要研究内容
• 第二章 麦拓莱霉素生物合成基因的克隆
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 生化试剂和仪器
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.3.1 滕黄灰链霉菌培养
• 2.1.3.2 大肠杆菌的培养
• 2.1.3.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.3.4 琼脂糖凝胶中目的片段的回收
• 2.1.3.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备
• 2.1.3.6 碱裂解法提取质粒
• 2.1.3.7 双酶切反应体系
• 2.1.3.8 滕黄灰链霉菌染色体DNA的提取
• 2.1.3.9 T载体连接反应
• 2.1.3.10 转化反应与蓝白筛选
• 2.1.3.11 DNA序列的测定
• 2.1.4 PCR反应体系与参数优化
• 2.1.5 同源克隆的克隆策略和引物设计
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 PCR扩增片段mai1
• 2.2.2 PCR扩增片段mai2
• 2.2.3 PCR扩增片段mai3
• 2.3 小结
• 第三章 PKS基因序列分析
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验工具与方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 mai-PKS序列的Frame分析
• 3.2.2 mai-PKS序列的Blast分析
• 3.2.3 限制性内切酶分析
• 3.2.4 mai-MT基因功能分析
• 3.2.5 mai-KS1 基因功能分析
• 3.2.6 mai-ACP基因功能分析
• 3.2.7 mai-KS2 基因功能分析
• 3.2.8 序列mai-PKS内KS基因功能分析
• 3.3 小结
• 第四章 β-酮酰基合成酶基因功能研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料与仪器
• 4.1.1.1 菌种和质粒
• 4.1.1.2 生化试剂和仪器
• 4.1.2 藤黄灰链霉菌的原生质体制备
• 4.1.3 穿梭质粒的构建
• 4.1.4 mai-KS2 阻断株构建
• 4.1.5 次生代谢产物的提取
• 4.1.6 生物活性检验
• 4.1.7 液质分离与鉴定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 mai-KS2 基因阻断株的构建
• 4.2.2 生物活性检测
• 4.2.3 次生代谢产物TIC图分析
• 4.2.4 次生代谢产物质谱分析
• 4.3 小结
• 第五章 总结和展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 附录1:全部基因序列信息
• 致 谢