热处理废弃重组质粒DNA的有效性与安全性分析

论文摘要

随着现代生物技术,特别是基因工程技术的高速发展,其对生态环境与人民健康可能造成的危害越来越引起人们的重视。生物实验室产生的废弃重组DNA片段的排放是造成重组DNA向自然界扩散的途径之一,并有可能导致“基因污染”,为此生物实验室含重组DNA片段的废弃物一般需经预处理后排放。热处理是目前生物实验室处置废弃重组DNA片段、核酸等物质的主要手段。本文以pET-28b质粒为材料,采用定量PCR技术结合电泳和质粒转化等手段研究了重组DNA片段在热处理过程中的降解与失活规律及其影响因素,考察和分析了热处理（热变性）的重组质粒DNA在模拟水环境中的降解速率以及潜在的环境风险。研究结果将可初步确定热处理废弃重组DNA的有效性和安全性,并为今后建立系统的废弃重组DNA生态风险评价技术和标准提供参考价值和技术支撑。实验结果显示,热处理过程中,由于高温和煮沸过程中剪切力的作用,pET-28b质粒DNA会发生解链和断裂,其降解半衰期约为2.7～4min,但30min后仍存在一级结构完整的质粒且仍具有3%～5%的转化活性。这表明热处理并不能彻底降解、破坏重组DNA片段,而主要使其解链变性。酸性条件能加速热处理过程中质粒DNA的降解,但环境中的离子强度、牛血清白蛋白（BSA）浓度、EDTA浓度都对热处理过程中的质粒DNA具有一定的保护作用,使其在热处理过程中的降解速率得到减缓,其中EDTA对热处理过程中质粒DNA的保护作用最强。由于生物实验室废水中通常含有上述有机或无机物质,因此实际热处理过程中质粒DNA的降解半衰期可能远长于2.7～4min,这一点必须引起我们高度关注。研究发现,热变性的质粒DNA经过复性可在一定程度上恢复其转化活性,在一定范围内温度越高越利于热变性质粒的复性。因此热处理（变性）的质粒DNA进入生态系统后如不能在短时问内被彻底降解,理论上存在着复性并恢复转移活性的可能。然而研究发现进入水环境的热处理（变性）重组DNA在短时间内并不能被彻底降解。pH对热处理（变性）的质粒DNA在水环境中的降解有一定的影响,在pH值为5、6、9的情况下,经过55min的降解,便无法从水中检测到一级结构完整的质粒DNA的存在,其中pH为9时,热处理（变性）重组DNA在水环境中的降解速度最快。pH值为7和8时,水环境中的热处理（变性）质粒DNA降解速率相对较慢,到1.6h后才无法检测到一级结构完整的质粒DNA的存在。水环境中的离子强度对热处理（变性）质粒DNA有一定的保护作用,而且这种作用是随着离子强度的提高而增强。当水环境中NaCl浓度达到0.5%时,2.2h之后仍然能在定量PCR中检测到一级结构完整的质粒DNA。研究结果表明目前常用的废弃重组DNA沸水热处理手段难以彻底降解、破坏重组质粒DNA的一级结构（主要使质粒DNA变性）,并仍具有一定的转化活性。热变性的质粒DNA一定时间后能恢复生物活性,而且热处理后的重组质粒DNA进入水环境后在短时间内并未被彻底降解,因此这些热处理（变性）的重组DNA一旦进入生态系统后,理论上有足够的时间复性并可能发生基因转移,所以该热处理方法存在一定的安全隐患。有关进入水环境中的热变性重组DNA的复性与转移的验证工作正在进行之中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 现代生物技术带来的环境问题及其研究现状
• 1.1.1 基因重组生物的安全性
• 1.1.1.1 重组基因安全问题的提出与发展
• 1.1.1.2 基因重组生物的生态风险与研究现状
• 1.1.2 生物实验室安全性问题
• 1.1.2.1 生物实验室废弃污染物类型与排放现状
• 1.1.2.2 国内外有关生物技术安全保障的法律法规
• 1.1.2.3 生物实验室废弃重组DNA片段的处理处置及存在的问题
• 1.2 研究背景、意义以及研究内容和技术路线
• 1.2.1 研究背景与意义
• 1.2.2 研究内容
• 1.2.3 技术路线
• 1.2.4 课题来源
• 第2章 热处理过程中质粒DNA的降解/变性规律
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 质粒DNA制备
• 2.2.2.2 质粒DNA热变性时间梯度处理
• 2.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.2.4 荧光定量PCR检测
• 2.2.2.5 质粒DNA转化效率检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 热处理过程中质粒DNA结构的时间变化规律
• 2.3.2 热处理过程中质粒DNA残留转化活性的时间变化规律
• 2.3.3 热处理过程中质粒DNA的降解速率与降解半衰期
• 2.4 小结
• 第3章 热处理过程中质粒DNA降解/变性的环境影响因素
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 pH梯度热处理
• 3.2.2.2 NaCl梯度热处理
• 3.2.2.3 BSA梯度热处理
• 3.2.2.4 EDTA梯度热处理
• 3.2.2.5 质粒转化与定量PCR检测
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 pH对质粒DNA热处理的影响
• 3.3.2 NaCl对质粒DNA热解过程的影响
• 3.3.3 BSA对质粒DNA热解的影响
• 3.3.4 EDTA对质粒DNA热解的影响
• 3.4 小结
• 第4章 热处理重组质粒DNA的复性及其在模拟水环境中的降解
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 质粒DNA的温度梯度复性
• 4.2.2.2 模拟水环境的建立
• 4.2.2.3 水环境中热变性质粒DNA降解效率分析
• 4.2.2.4 质粒DNA的定量PCR检测
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 热处理质粒DNA的复性效率
• 4.3.2 热变性质粒DNA在不同pH水环境中的降解与残留时间
• 4.3.3 水环境中的离子强度对热变性质粒降解的影响
• 4.4 小结
• 第5章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 致谢
• 参考文献
• 个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果