论文摘要
本论文阐述了对罗伦隐球酵母B40（Cryptococcus laurentii B40）的发酵配方改良、该菌产生的脂肪酶的纯化及酶学特性等方面的研究。通过对发酵培养基的优化，确定了其适宜的发酵配方；通过硫酸铵沉淀、DEAE Sephadex A-25离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析等纯化步骤，对其发酵液进行了纯化，得到了电泳纯脂肪酶；通过SDS-PAGE初步确定其表观分子量约为21 KD。并对其作用温度和pH等酶学特性进行了研究。本论文还阐述了利用定点突变技术创建扩展青霉脂肪酶（Penicillium expansum lipase，PEL）的随机突变体ep8与R182K的叠加突变体，其酶活与野生型PEL和随机突变体PEL-ep8相比都有所提高。1．罗伦隐球酵母B40脂肪酶的分离纯化及特性分析罗伦隐球酵母B40是一株可以分泌脂肪酶的酵母菌。作者设计了多种培养基配方对其发酵培养基进行优化。通过考查其菌体生长、发酵酶活及是否有利于分离纯化等指标。确定了菌体生长好、发酵酶活高并易于分离纯化的培养基配方：玉米粉0.5％，豆饼粉2％，（NH4）2SO40.1％，Na2HPO4·12H2O 0.2％，MgSO4·7 H2O0.25％，CaCl2 0.01％，发酵培养基初始pH7.2。通过硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-25离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析等步骤，作者从C．laurentii B40的发酵上清中纯化获得了电泳纯脂肪酶。该酶可在三丁酸甘油酯检验板上形成水解透明圈，其表观分子量约为21KD，是一种分子量较小的脂肪酶。该酶在35-45℃的范围内，有较高活性，其最适作用温度为43℃。在pH 9.2-12.2的范围内，酶的活性较高，其最适作用pH为pH10.7；在55℃以下，pH5.0-11.2的范围内，该酶有很好的稳定性。在所检测的金属离子中，多数对该酶酶活有抑制作用，尤其是Zn2+、Hg2+、Cu2+、Al3+；表面活性剂0.05％Triton-100、0.5mM sodium Desoxycholate对该酶酶活有明显的促进作用，0.05％SDS、0.05％EDTA则对其有强烈的抑制作用。该酶对短链的脂肪酶具有偏爱性。作者还对该脂肪酶进行了N端序列的测定，但由于该脂肪酶的N端可能是封闭的，目前还未获得其N端氨基酸序列。2．扩展青霉脂肪酶叠加突变体PEL-ep8-R182K的构建利用重叠延伸PCR对扩展青霉脂肪酶（PEL）基因进行体外定点突变，构建了R182K与随机突变体ep8叠加突变的重组质粒pA0815-ep8-R182K。将该质粒电转化引入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115，进行异源表达。实验结果表明：该叠加突变体在毕赤酵母中获得了活性表达，得到表达产物脂肪酶PEL-ep8-R182K。在最适作用温度下，其比活为1461.3 U／mg，分别比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS（1407.07 U／mg）和野生型脂肪酶PEL-GS（1281.5 U／mg）提高了3.86％、14.03％。叠加突变脂肪酶PEL-ep8-R182K-GS的最适作用温度为40℃，与野生型脂肪酶PEL-GS和随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS的一致；其Tm值为38.71℃，与野生型脂肪酶PEL-GS（38.81℃）的相似，比随机突变脂肪酶PEL-ep8-GS（40.96℃）下降了2.25℃。
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标签：扩展青霉脂肪酶论文; 罗伦隐球酵母脂肪酶论文; 定点突变论文; 分离纯化论文;