钾通道阻断剂对人乳腺上皮细胞增殖的影响及与Caveolin-1蛋白表达关系的研究

论文摘要

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,是乳腺导管上皮细胞在各种内外致癌因素的作用下,失去正常特性而异常增生,以致超过自我修复的限度而发生癌变的疾病。研究表明,许多遗传中与乳腺有关的异常基因和后天受致癌因素影响发生的基因变化参与这一过程。但到目前为止,乳腺上皮细胞恶性转化的分子机制仍不十分清楚,导致乳腺癌发病机理的研究难以取得突破性进展。Caveolin-1（Cav-1,窖蛋白,曾译为小窝蛋白）是Caveolae（胞膜窖）的标志蛋白,主要表达于终末分化的细胞。近年研究发现, Cav-1与乳腺上皮细胞转化和乳腺癌发生密切相关。在我们实验室前期的研究中,利用基因捕获技术得到稳定传代的Cav-1单倍不足（haploinsufficiency）人乳腺上皮细胞株（MCF10A-ST1）,Cav-1的mRNA和蛋白质表达均明显降低。进一步研究证实,Cav-1单倍不足可以通过上调乳腺上皮细胞内增殖相关的MAPK信号转导通路等导致人乳腺上皮细胞早期转化,但与Caveolae内其它信号分子的关系尚不完全清楚。钾离子通道（K+通道）是细胞膜上具有转运离子能力的一类重要功能蛋白质,参与细胞许多重要的新陈代谢活动,例如,细胞的增殖、溶质转运、体积控制、酶的激活、细胞分泌、基因表达、兴奋性收缩的传递及细胞内通讯等等。近年来发现,乳腺细胞膜上分布着不同类型的K+通道,其生理机能的改变与乳腺癌的发生发展有着重要的联系。已经证实,多种重要的离子通道定位在Caveolae上,其通道活性受Caveolae的调节。本实验以Cav-1表达水平不同的人乳腺上皮细胞MCF10A、MCF10A-ST1和乳腺癌细胞MCF7为研究对象,首先通过MTT法检测了K+通道阻断剂TEA和4-AP等对三种乳腺细胞和乳腺癌细胞增殖的影响;其次,利用RT-PCR和免疫印迹方法检测了不同Kv通道在三种细胞中的表达水平及免疫共沉淀技术检测了Kv1.5与Cav-1的共表达关系;第三,观察了K+通道阻断剂4-AP作用后对三种细胞中MAPK通路蛋白的影响,旨在探讨K+通道在乳腺细胞早期转化中的作用与Cav-1介导的信号通路的关系,进一步阐明乳腺癌发生、发展的分子机制,为乳腺癌的早期诊断和治疗提供新思路。得到如下结果:1. K+通道的特异性阻断剂TEA和Kv通道阻断剂4-AP均对人乳腺上皮细胞MCF10A、MCF10A-ST1和乳腺癌细胞MCF7的增殖具有抑制作用,且呈剂量时间依赖性。提示乳腺细胞上有大量的K+通道或Kv通道存在,而且K+通道对细胞生长十分重要。2. Kv通道在不同人乳腺上皮细胞中的表达不同,MCF10A细胞中Kv1.5表达水平最高,MCF10A-ST1中表达次之,MCF7细胞中表达最低,而Kv1.2等的表达没有明显差距,这一结果与三种细胞中Cav-1的表达水平一致,且免疫共沉淀显示了Kv1.5与Caveolae具有直接的关系。提示K+通道在乳腺细胞增殖中的作用可能与Cav-1有关。3. Kv通道阻断剂4-AP可能影响MAPK蛋白磷酸化MAPK蛋白。MCF10A、MCF10A-ST1、MCF7细胞单纯4-AP作用对三种细胞p-ERK1/2表达无影响。进一步,4-AP作用后血清刺激,p-ERK1/2表达水平明显增加。结论:1.人乳腺上皮细胞分布不同的Kv通道,影响乳腺细胞的增殖和转化。2.Kv1.5可能参与乳腺细胞的早期转化过程,其表达和功能可能受Cav-1导的信号通路的调节。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 离子通道与乳腺癌关系研究进展
• +通道与乳腺癌'>1 K⁺通道与乳腺癌
• +通道与乳腺癌的发生'>1.1 K⁺通道与乳腺癌的发生
• +通道与乳腺癌细胞的增殖'>1.2 K⁺通道与乳腺癌细胞的增殖
• +通道与乳腺癌细胞的转移'>1.3 K⁺通道与乳腺癌细胞的转移
• -通道与乳腺癌'>2 Cl^-通道与乳腺癌
• +通道与乳腺癌'>3 Na⁺通道与乳腺癌
• 2+通道与乳腺癌'>4 Ca²⁺通道与乳腺癌
• 2+通道与乳腺癌的发生'>4.1 Ca²⁺通道与乳腺癌的发生
• 2+通道与乳腺癌的增殖和转移'>4.2 Ca²⁺通道与乳腺癌的增殖和转移
• 5 水通道与乳腺癌
• 6 总结
• 参考文献
• 第二章 几种离子通道阻断剂对人乳腺上皮细胞增殖影响的比较
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 材料与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 MTT 法检测 NPPB、TEA、4-AP 对乳腺细胞增殖的影响
• 1.2.3 细胞爬片的制作及形态学观察
• 2 结果
• 2.1 TEA 对乳腺细胞和乳腺癌细胞增殖的影响
• 2.2 4-AP 对乳腺细胞和乳腺癌细胞增殖的影响
• +通道阻断剂对细胞形态的影响'>2.3 K⁺通道阻断剂对细胞形态的影响
• 2.4 甘露醇对乳腺细胞和乳腺癌细胞增殖的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 不同电压门控钾通道在人乳腺上皮细胞中的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.1.1 主要仪器
• 1.1.2 材料与试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 RT-PCR 半定量检测相关基因 mRNA 的变化
• 1.2.3 免疫印迹法检测相关蛋白的表达
• 1.2.4 免疫共沉淀检测蛋白之间的相关性
• 2 结果
• 2.1 Cav-1 在不同乳腺细胞中的表达
• 2.2 RT-PCR 检测不同 Kv 通道在不同乳腺细胞中的表达
• 2.3 免疫印迹法检测不同 Kv 通道在不同乳腺细胞中的表达
• 2.4 Kv1.5 与 Cav-1 关系的研究
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 在人乳腺细胞中 4-AP 影响 MAPK 蛋白磷酸化
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞培养
• 1.2.2 4-AP 作用不同乳腺上皮细胞
• 1.2.3 免疫印迹法检测相关蛋白的表达
• 2 结果
• + 通道阻断剂对 MCF10A 细胞中 MAPK 蛋白磷酸化的影响'>2.1 K⁺ 通道阻断剂对 MCF10A 细胞中 MAPK 蛋白磷酸化的影响
• + 通道阻断剂对 MCF10A-ST1 细胞中 MAPK 蛋白磷酸化的影响'>2.2 K⁺ 通道阻断剂对 MCF10A-ST1 细胞中 MAPK 蛋白磷酸化的影响
• + 通道阻断剂对 MCF7 细胞中 MAPK 蛋白磷酸化的影响'>2.3 K⁺ 通道阻断剂对 MCF7 细胞中 MAPK 蛋白磷酸化的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 小结
• 1 主要结论
• 2 特色与创新点
• 3 有待进一步开展的工作
• 致谢
• 个人简历