大豆脂肪氧化酶的鉴定、纯化及其漂白β-胡萝卜素的酶学特性研究

论文摘要

大豆脂肪氧化酶（LOX）能专一催化含有cis,cis-1,4戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸,通过分子内加氧形成具有共轭双键的氢过氧化物,氢过氧化物具有高度的反应性,是医药、化工、食品等行业重要的中间体。特别是脂氧酶对β-胡萝卜素具有氧化漂白作用,应用这一原理,可以将其作为一种安全、有效的面粉漂白剂,在食品加工中广泛地应用。因此有必要考察LOX鉴定、纯化方法以及它漂白β-胡萝卜素的基本性质及影响其活性的因素,为研究LOX的酶促反应及机理提供理论基础,为大豆脂氧酶的开发应用提供理论依据。本论文主要研究三方面的问题,即大豆脂氧酶的SDS-PAGE鉴定方法、脂肪酶纯化方法以及它漂白β-胡萝卜素的基本性质及影响其活性的因素。通过实验可以得出以下几方面的结论:1采用SDS-PAGE检测脂肪氧化酶的重复性好,该方法可以用于犬豆脂肪氧化酶缺失类型的检测。本方法的最佳分离胶浓度为11%,最佳电泳时间为电泳在溴酚蓝带溢出分离胶90min时结束,最佳电泳样品上样量为5uL。2大豆脂氧酶粗酶液经过凝胶过滤色谱superdex75,收集的酶液经过离子交换色谱Mono Q再通过反相液相色谱RPC就可得到纯净的大豆脂氧酶。其中凝胶过滤色谱superdex-75纯化条件:缓冲溶液pH6.8 0.1mol/L磷酸缓冲液;流速0.5mL/min;压力0.7MPa。离子交换Mono Q实验条件:初始缓冲液:0.05M pH7.5 Tris-Hcl;极限缓冲液0.05M TriS-Hcl+1M Nacl（pH7.5）;流速1.0mL/min。反相液相色谱RPC实验条件:流动相A液:超纯水+0.1%TFA;B液:乙腈+0.1%TFA;流速1.0mL/min;压力1.02MPa。3大豆脂肪氧化酶同功酶在不同条件下对β-胡萝卜素的漂白能力差异很大,LOX1、LOX2、LOX3、LOX1,2、LOX1,2,3用0.05 mol/LpH 6.8 Tris-HCl提取大豆脂氧合酶效果最好,而LOX1,3和LOX2,3适合用0.2 mol/L pH 6.0磷酸缓冲液提取;将脂肪氧化酶加入含有胡萝卜素的溶液中反应18 min均能完全反应;LOX1,3和LOX1,2,3在4℃下有最大的漂白能力,而LOX2、LOX3和LOX2,3在27℃漂白能力最强,而LOX1则是在80℃;LOX1在pH 9.0处有最大酶活,LOX2和LOX1,2,3在pH 6.8处漂白能力最强,LOX3、LOX1,2、LOX1,3、LOX2,3在pH 7.0处有最大的漂白能力;脂氧化酶同功酶在酶液提取6小时内对β-胡萝卜素的漂白能力变化不大。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 大豆脂肪氧化酶的理化特性
• 1.1 大豆脂肪氧化酶的含量和分类
• 1.1.1 大豆脂肪氧化酶的含量
• 1.1.2 大豆脂肪氧化酶的分类
• 1.2 大豆脂肪氧化酶的结构
• 1.3 大豆脂肪氧化酶的酶促反应机制
• 2 大豆脂肪氧化酶的分析鉴定技术
• 2.1 氧电极、量压法与分光光度法
• 2.1.1 氧电极法
• 2.1.2 量压法（Warburg呼吸仪法,AACC方法）
• 2.1.3 分光光度法（Kanofsky JR,Axelrod B,1986）
• 2.2 胡萝卜素脱色法
• 2.3 电泳法
• 2.3.1 聚丙烯酰胺-SDS电泳（SDS-PAGE）
• 2.3.2 等电聚焦聚丙烯酰胺电泳（IEF-PAGE）
• 2.4 专—性抗体互作和酶联免疫法（ELISA）酶联免疫法
• 2.5 阳离子交换高压液相色谱和快速蛋白液相色谱
• 2.6 显色法
• 2.6.1 亚甲基兰法
• 3显色法（Grossman S et al,1969）'>2.6.2 Fe（CNS）₃显色法（Grossman S et al,1969）
• 2淀粉法（Hisateru M,1967）'>2.6.3 KI₂淀粉法（Hisateru M,1967）
• 2.7 超弱发光发射光谱法
• 2.8 分子标记
• 3 大豆脂肪氧化酶的提取纯化
• 3.1 大豆脂氧酶提取方法
• 3.1.1 水浸提法
• 3.1.2 缓冲液浸提法
• 3.1.3 盐析法
• 3.1.4 共沉淀法
• 3.2 大豆脂肪氧化酶纯化技术
• 3.2.1 离子交换层析
• 3.2.2 凝胶过滤
• 3.2.3 亲和层析
• 3.2.4 疏水色谱（HIC）
• 4 大豆脂肪氧化酶漂白β-胡萝卜素的原理
• 5 大豆脂肪氧化酶在食品中的应用
• 5.1 大豆脂肪氧化酶的漂白和抗老化作用
• 5.2 制备风味物质
• 6 本研究的意义与内容
• 6.1 研究意义
• 6.2 研究内容
• 6.2.1 大豆脂肪氧化酶同功酶的鉴定
• 6.2.2 大豆脂肪氧化酶同功酶的纯化
• 6.2.3 大豆脂肪氧化酶同功酶漂白β-胡萝卜素的酶活特性研究
• 第二章 利用SDS-PAGE鉴定大豆脂肪氧化酶同功酶
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要化学试剂
• 1.3 主要实验仪器与设备
• 1.4 电泳实验方法
• 1.4.1 贮液的配制
• 1.4.2 大豆脂肪氧化酶的提取
• 1.4.3 电泳样品的准备
• 1.4.4 电泳
• 1.4.5 染色及脱色
• 2 结果与分析
• 2.1 不同SDS-PAGE电泳时间鉴定大豆脂肪氧化酶同功酶
• 2.2 不同上样量SDS-PAGE电泳鉴定大豆脂肪氧化酶同功酶
• 2.3 SDS-PAGE电泳不同分离胶浓度鉴定大豆脂肪氧化酶同功酶
• 2.3.1 不同凝胶浓度的配置
• 2.3.2 不同分离胶浓度SDS-PAGE电泳鉴定大豆脂肪氧化酶同功酶
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 大豆脂肪氧化酶的纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要化学试剂
• 1.3 主要实验仪器与设备
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 试剂配制
• 1.4.2 大豆脂肪氧化酶粗酶液制备
• 1.4.3 蛋白含量测定（Bradford法）
• 1.4.4 SDS-PAGE分析
• 1.4.5 银染
• 1.4.6 硫酸铵沉淀
• 1.4.7 胡萝卜素漂白实验
• 2 实验结果
• 2.1 硫酸铵分段提取大豆脂氧酶
• 2.2 凝胶过滤（以LOX1为例）
• 2.2.1 凝胶过滤色谱Sephacyl-S300
• 2.2.2 凝胶过滤色谱superdex-75
• 2.2.3 凝胶过滤色谱sephadex-G100
• 2.3 离子交换色谱（以LOX1为例）
• 2.3.1 sephadex-G100→DEAE52
• 2.3.2 superdex-75→Mono Q
• 2.4 反相液相色谱RPC（以LOX1为例）
• 2.5 SDS-PAGE银染
• 3 讨论
• 4 结论
• 第四章 大豆脂肪氧化酶同功酶漂白β-胡萝卜素的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 大豆脂氧合酶提取液
• 1.3.2 缓冲溶液的制备
• 1.3.3 底物的制备
• 1.3.4 胡萝卜素饱和丙酮溶液
• 1.3.5 大豆脂肪氧化酶粗酶液制备
• 1.3.6 胡萝卜素漂白实验
• 1.4 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 不同提取液提取的大豆脂肪氧化酶同功酶漂白能力比较
• 2.2 大豆脂肪氧化酶同功酶漂白β-胡萝卜素的作用时间
• 2.3 温度对大豆脂氧合酶漂白β-胡萝卜素的影响
• 2.4 pH值对大豆脂肪氧化酶漂白活性的影响
• 2.5 大豆脂肪氧化酶漂白β-胡萝卜素的稳定性
• 3 结论
• 主要结论及工作展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢