黄瓜白粉病抗性基因的分子标记研究

论文摘要

黄瓜，世界上目前栽培最为广泛的蔬菜之一，人民生活中最常见的一种蔬菜。黄瓜白粉病（Podosphaeva xanthii Syn. Sphaerotheca fuliginea）是一种潜伏期短、再侵染速度快、流行性强的世界性黄瓜主要病害之一，特别是随着保护地的发展，该病危害越来越严重，在我国南北各地的黄瓜主产区几乎周年性地频繁发生，造成严重经济损失，也成为绿色有机生产的主要障碍。安全、环保和高效地控制黄瓜白粉病的根本措施就是培育出高抗白粉病新品种。由于黄瓜白粉病的病原属于专性活体寄生菌，而且发病情况受环境影响较大，导致田间抗性鉴定与筛选的效率低、周期长。与田间鉴定相比，分子标记辅助筛选具有不受环境影响、早期、快速和高效的优点。随着分子生物学的研究的不断深入，对育种来言，筛选到与黄瓜白粉病抗性基因紧密连锁的分子标记有重大意义。随着分子生物学技术的不断发展，黄瓜白粉病病的研究有了新的手段和方法。我们以抗病品系“11-1-2-8-1-2-1-2（M1）”和感病品系“6-1-1-1-1-1-2（M2）”及其构建的F2代群体为基础材料，利用AFLP、SRAP、两种分子标记方法进行黄瓜白粉病抗病基因的分子标记的研究，结果如下：（1）对双亲及其杂交后代抗病性鉴定结果表明，F2群体中有6株表现为抗白粉病菌、159株表现为感病，41株表现为中间类型即中抗类型，经适合性测验群体抗感分离比例基本符合1:3：12模式（χ2=3.95，P≦0.05）。可推测黄瓜白粉病抗性由1对隐性主基因（s）和1对显性抑制基因（I）共同控制，并且I基因的表达受环境影响。当I存在且处于有利于其表达的环境时，I抑制了S和s基因表达，植株表现为感病，感病植株基因型为SI和ssI。当I不存在时（即ii），纯合隐性s基因表达完全抗病，基因型为ssii；而纯合SS或杂合Ss基因表现出一定的抗病性，即中间类型，其基因型为Sii。我们的这个推论与Morishita et al （2003）相一致（2）根据BSA法建立抗、感病池，利用AFLP分子标记技术对黄瓜白粉病进行了研究。20条EcoRI扩增引物与18条MseI扩增引物相互组合，共计360对AFLP引物对，对黄瓜白粉病抗病基因的AFLP标记进行筛选，共扩增出了大约20000条带。，得到了2对AFLP标记E2（E-AAG）/M55（M-CGA）和E2（E-AAG）/M62（M-CTT）。在抗、病亲本池和抗病池中都能稳定的扩增出差异片段，然后将2对引物进行了40株抗感单株小群体验证，证明两引物对分别在整个F2内该标记的连锁性差或者不连锁，没有测序的必要性，因此获得的2条AFLP特异条带未割胶回收侧序。（3）应用SRAP分子标记技术结合群分法在抗病品系“11-1-2-8-1-2-1-2（M1）”和感病品系“6-1-1-1-1-1-2（M2）”及抗病池（BR）和感病池（BS）中筛选与黄瓜白粉病紧密连锁的分子标记。从437对SRAP引物组合中进行筛选，仅有62对引物组合可以在两个亲本抗感池间扩增出稳定的多态性条带，占所用引物组合总数的14%，找到1个与抗性基因连锁的SRAP标记。经过小群体检测得到的遗传距离为9.8cM，筛选到的标记与抗病基因连锁。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 分子标记
• 1.1.1 几种常用的分子标记
• 1.1.2 分子标记在在葫芦科主要瓜类作物育种上的应用
• 1.2 黄瓜白粉病的发生、危害以及防治措施
• 1.2.1 黄瓜白粉病的发生和危害
• 1.2.2 防治措施
• 1.3 葫芦科作物白粉病的分子标记研究进展
• 1.3.1 葫芦科作物白粉病菌生理小种的研究
• 1.3.2 黄瓜白粉病抗性遗传规律研究现状
• 1.3.3 葫芦科作物白粉病分子标记研究现状
• 1.4 本试验的目的和意义
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 黄瓜白粉病鉴定
• 2.2.1 白粉病菌源
• 2.2.2 接种菌源的制备
• 2.2.3 接种方法
• 2.2.4 病情调查与分级标准
• 2.3 实验用的试剂和仪器
• 2.3.1 实验用的试剂
• 2.3.2 仪器
• 2.4 基因组 DNA 的制备
• 2.4.1 黄瓜基因组 DNA 的提取与纯化
• 2.4.2 基因组 DNA 的检测
• 2.5 黄瓜白粉病亲本利用已知 SCAR 标记筛选
• 2.6 抗病池与感病池的构建
• 2.7 AFLP 分子标记的分析
• 2.7.1 AFLP 分子标记所用到的接头与引物序列
• 2.7.2 AFLP 方法
• 2.7.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.7.4 银染与显色
• 2.7.5 多态性 AFLP 引物的筛选
• 2.8 黄瓜白粉病抗性 SRAP 分子标记研究
• 2.8.1 实验材料
• 2.8.2 引物来源
• 2.8.3 SRAP-PCR 的反应体系以及反应程序
• 2.8.4 多态性 SRAP 引物的筛选
• 2.8.5 多态性 SRAP 标记在 F2群体验证
• 2.8.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性条带的回收
• 2.8.7 琼脂糖上 DNA 片段的回收
• 2.8.8 目的片段的克隆、转化及测序
• 3 结果与分析
• 3.1 黄瓜材料白粉病抗性鉴定及遗传分析
• 3.2 DNA 提取与检测
• 3.3 黄瓜白粉病亲本利用已知 SCAR 标记筛选结果分析
• 3.4 BSA 方法的分析
• 3.5 与黄瓜白粉病相关基因的 AFLP 分子标记分析
• 3.5.1 酶切连接结果分析
• 3.5.2 预扩增与选择扩增
• 3.6 与黄瓜白粉病相关基因的 SRAP 分子标记分析
• 3.6.1 SRAP 标记的筛选
• 3.6.2 与黄瓜白粉病抗性相关基因的分子标记的获得
• 3.6.3 目标片端的回收
• 3.6.4 重组质粒的克隆
• 3.6.5 重组质粒的检测分析
• 3.6.6 遗传连锁分析
• 3.6.7 遗传连锁分析
• 4 讨论
• 4.1 黄瓜白粉病的抗性遗传分析
• 4.2 F2代分离群体用于分子检测可靠性分析
• 4.3 实验的几点体会
• 4.3.1 DNA 提取与纯度的问题
• 4.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 4.3.3 AFLP 实验部分
• 4.3.4 SRAP 实验部分
• 4.4 DNA 片段克隆的体会
• 4.5 AFLP 与 SRAP 两种方法多态性的比较
• 4.6 所得标记在遗传育种中的用途
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文: