叶籽银杏EFRO发育过程中DNA甲基化修饰机理及系统学意义

论文摘要

银杏（Ginkgo biloba L）有许多原始和进化特征。银杏属实际上可能是现存的种子植物中最古老的一个属。国内外大量研究表明银杏是比较形态学、解剖学、胚胎发育及系统发育研究的最理想的试材之一。叶籽银杏（Ginkgo biloba var. epiphylla Mak.）作为银杏家族中的一个特异种质,具有重要的理论和观赏价值。其最大特点在于叶生雌性生殖器官（epiphyllous female reproductive organ,EFRO）的个体发生和结构。它们对银杏的系统发育、起源、演化及亲缘关系的研究具有重要意义。本研究通过对叶籽银杏叶生雌性生殖器官（EFRO）发育与再生过程中DNA甲基化分子机制的研究,以期揭示叶籽银杏雌性生殖器官的形态学本质及其系统学意义。其实验结果和主要结论如下:本研究采用甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）,以叶籽银杏、银杏及攀枝花苏铁、铁线蕨两个外类群为材料,从54对MSAP选扩增引物中,选出扩增清晰、可辨且可重复的16-24对MSAP引物组合,扩增获得这四个物种的DNA胞嘧啶甲基化修饰水平及MSAP扩增图谱,结果表明叶籽银杏基因组中至少有48.7%（全甲基化34%、半甲基化14.7%）、银杏44.0%（全甲基化32.8%、半甲基化11.2%）、苏铁39.6%（全甲基化29.2%、半甲基化9.8%）、铁线蕨44.6%（全甲基化29.4%、半甲基化15.2%）的CCGG/GGCC位点发生胞嘧啶甲基化。与相关物种比较,这四个物种的DNA胞嘧啶甲基化水平整体较高。植物基因组DNA胞嘧啶甲基化修饰检出率不同,反映了在基因组水平上的物种的差异性。本研究通过对叶籽银杏、银杏在萌动期和展叶期的CCGG/GGCC位点胞嘧啶甲基化进行的总体分析,结果发现萌动期叶籽银杏甲基化水平47.6%、银杏42.4%,展叶期叶籽银杏着生叶生胚珠的叶籽银杏（YZ）甲基化水平48.3%、没有着生叶生胚珠的叶籽银杏（YC）40.5%、银杏（CK）41.5%,体现为叶籽银杏的甲基化高于YC及CK;同时叶籽银杏、银杏在甲基化模式上存在着丰富的差异,萌动期叶籽银杏相对于银杏去甲基化比例为13.2%,超甲基化比例为14.6%,超甲基化的比例略高于去甲基化;展叶期YZ相对于YC去甲基化比例为8.2%,超甲基化比例为16.0%,YZ相对于CK去甲基化比例为4.8%,超甲基化比例为28%,总体表现为展叶期的YZ相对于YC及CK的超甲基化水平高于萌动期的超甲基化水平。显示萌动期与展叶期叶籽银杏甲基化修饰的水平不同。说明叶籽银杏EFRO发育过程中胞嘧啶甲基化具有时空特异性。本研究对叶籽银杏不同组织DNA胞嘧啶甲基化的水平、模式及模式上的差异类型进行分析,结果发现叶籽银杏不同组织DNA胞嘧啶甲基化的水平不同,其发端期47.7%、雌配子发育前期（前期）46.0%、雌配子发育中期（中期）45.2%、雌配子发育后期（后期）41.8%、叶籽银杏正常胚珠胚乳初期（CK）35.3%。不同组织在甲基化模式上也存在着广泛的差异,表现为发端期相应于前期去甲基化比例为19.7%、超甲基化比例为14.6%,中期去甲基化比例20.0%、超甲基化比例为13.30%,后期去甲基化比例为20.3%、超甲基化比例为14.6%,CK去甲基化比例为20.3%,超甲基化比例为18.8%。不同组织甲基化模式上的差异体现为发端期组织相对于雌配子发育的三个时期的组织（前期、中期、后期）及叶籽银杏正常胚珠胚乳初期组织（CK）的去甲基化水平高于超甲基化水平,发生了去甲基化,这个时期有更多的基因表达,是叶籽银杏EFRO形成的关键时期。叶籽银杏在不同时期、不同组织这种去甲基化/超甲基化的变化式样,对揭示叶籽银杏EFRO形成的可能机制及系统学意义奠定了基础。本研究从54对MSAP选扩引物中,选出16对MSAP选扩引物组合,扩增产生叶籽银杏不同单株清晰可辨的MSAP扩增图谱,检测其甲基化水平,发现不同单株甲基化水平不同,其中,沂源油坊（I油坊）为47.2%、沂源织女洞南（I织南） 44.09%、沂源织女洞北（I织北） 43.8%、沂源白裕（I白裕） 43.3%、沂源中河（I中河） 43.5%、泰安老君堂正常银杏（CK）39.7%。不同单株在甲基化模式上也存在着广泛的差异, I油坊相对于I织南、I织北、CK的去甲基化比例分别为8.7%、13.3%和8.42%,超甲基化比例分别为27.1%、11.22%、13.68%。在同一时期,I油坊较之其他几株表现为较高的超甲基化水平,或许与I油坊树龄大（树龄为1300年,其余在700年左右）有关。即植物形态的构成与年龄有一定的关联。本研究采用分子生物学技术,对部分叶籽银杏、银杏修饰位点及叶籽银杏多态性位点进行克隆和序列分析,通过匹配的同源序列功能注释,发现叶籽银杏、银杏基因组中包括大量的重复序列、转座子序列、转录调控因子、反转录转座子序列、F-box蛋白、叶绿体通道蛋白、钠离子通道蛋白、泛素蛋白、假设蛋白及乙酸脱氢酶在内的多种类型DNA序列中均存在DNA甲基化修饰现象。这些基因在叶籽银杏和银杏中的甲基化状态被修饰的程度不同,表明它们可能有助于叶籽银杏和银杏间的表型差异的形成,对于解读叶籽银杏的形成机制具有一定的意义。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 表观遗传学
• 1.2 植物DNA 甲基化（DNA METHYLATION）研究进展
• 1.2.1 DNA 甲基化的分布
• 1.2.2 植物DNA 甲基化作用方式
• 1.2.3 植物DNA 的去甲基化
• 1.2.4 DNA 甲基化的生物学意义
• 1.2.4.1 DNA 甲基化与植物生长发育
• 1.2.4.2 DNA 甲基化调节基因表达
• 1.2.4.3 DNA 甲基化维持基因组稳定性
• 1.2.5 DNA 甲基化的水平
• 1.2.6 木本植物甲基化的研究
• 1.2.7 DNA 甲基化的检测方法
• 1.2.7.1 DNA 甲基化敏感扩增多态性
• 1.2.7.2 高效液相色谱法
• 1.2.7.3 亚硫酸盐测序
• 1.3 银杏（GINKGO BILOBA L）研究进展
• 1.4 叶籽银杏研究进展
• 1.5 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验材料的采集
• 2.1.1.1 萌动期叶籽银杏试验材料的采集
• 2.1.1.2 展叶期叶籽银杏试验材料的采集
• 2.1.1.3 不同组织叶籽银杏试验材料的采集
• 2.1.1.4 不同发育时期正常银杏试验材料的采集
• 2.1.1.5 苏铁、铁线蕨试验材料的采集
• 2.1.2 其他材料的准备
• 2.1.2.1 菌株和载体
• 2.1.2.2 主要仪器
• 2.1.2.3 酶和试剂
• 2.1.2.4 主要数据库及生物软件
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 基因组DNA 的提取
• 2.2.1.1 改良的CTAB 法提取基因组DNA
• 2.2.1.2 采用试剂盒提取基因组DNA
• 2.2.2 银杏基因组DNA 过柱纯化
• 2.2.3 模板DNA 纯度与浓度检测
• 2.2.4 常用试剂的配制
• 2.2.5 克隆和测序
• 2.2.5.1 PCR 产物的纯化
• 2.2.5.2 回收片段加A 尾巴
• 2.2.5.3 连接
• 2.2.5.4 感受态细胞的制备和转化
• 2.2.5.5 小量质粒DNA 制备
• 2.2.5.6 重组质粒的酶切鉴定和测序
• 2.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.7 SOUTHERN 杂交分析
• 2.2.8 银杏基因组DNA 的甲基化MSAP 分析
• 2.2.8.1 DNA 双链的酶切
• 2.2.8.2 基因组DNA 接头的准备
• 2.2.8.3 基因组DNA 接头的连接
• 2.2.8.4 基因组DNA 的预扩增
• 2.2.8.5 基因组DNA 的选择性扩增
• 2.2.8.6 PAGE 制作与条件筛选
• 2.2.8.7 读带及分析
• 2.2.9 甲基化修饰片段的回收、克隆及测序
• 2.2.9.1 甲基化修饰片段的回收和二次扩增
• 2.2.9.2 二次扩增修饰片段的纯化
• 2.2.9.3 重组质粒的PCR 鉴定
• 2.2.10 小提质粒后，进行酶切鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 银杏全基因组DNA 甲基化水平、模式的研究
• 3.1.1 MSAP 技术体系的优化
• 3.1.1.1 酶切体系的优化
• 3.1.1.2 预扩增体系的优化
• 3.1.1.3 选扩增体系的优化
• 3.1.2 银杏基因组DNA 甲基化水平
• 3.1.2.1 DNA 的提取
• 3.1.2.2 纯度和含量的测定
• 3.1.3 银杏基因组DNA 甲基化模式分析
• 3.1.3.1 酶切结果
• 3.1.3.2 预扩增和选扩增结果
• 3.1.3.3 银杏MSAP 扩增图谱构建
• 3.1.3.4 基因组DNA 甲基化修饰水平分析
• 3.1.3.5 修饰位点回收和二次扩增结果
• 3.1.3.6 修饰位点片段克隆测序结果
• 3.1.3.7 DNA 甲基化修饰位点序列分析
• 3.2 苏铁、铁线蕨全基因组DNA 甲基化分析
• 3.2.1 苏铁、铁线蕨DNA 的提取
• 3.2.1.1 苏铁、铁线蕨DNA 的提取
• 3.2.1.2 苏铁、铁线蕨DNA 纯度和含量的测定
• 3.2.2 酶切结果
• 3.2.3 苏铁、铁线蕨基因组DNA 预扩增及选扩增图
• 3.2.4 苏铁、铁线蕨MSAP 扩增图谱构建
• 3.2.5 基因组DNA 甲基化修饰水平分析
• 3.3 叶籽银杏EFRO 发育过程中DNA 甲基化的研究
• 3.3.1 叶籽银杏基因组DNA 提取
• 3.3.1.1 萌动期叶籽银杏基因组DNA 提取
• 3.3.1.2 展叶期叶籽银杏基因组DNA 的提取
• 3.3.1.3 雌配子发育期不同组织叶籽银杏基因组DNA 的提取
• 3.3.2 叶籽银杏基因组DNA 的甲基化MSAP 分析
• 3.3.2.1 叶籽银杏基因组DNA 甲基化修饰位点的分析
• 3.3.2.2 叶籽银杏MSAP 扩增图谱构建
• 3.3.2.3 叶籽银杏甲基化修饰水平的分析
• 3.3.4 萌动期叶籽银杏甲基化水平、模式及位点的差异分析
• 3.3.4.1 萌动期叶籽银杏基因组DNA 的甲基化MSAP 分析
• 3.3.4.1.1 酶切结果
• 3.3.4.1.2 预扩增结果
• 3.3.4.2 萌动期叶籽银杏、银杏DNA 胞嘧啶甲基化的水平
• 3.3.4.3 萌动期叶籽银杏、银杏MSAP 扩增图谱构建
• 3.3.4.4 萌动期叶籽银杏、银杏在甲基化模式上的差异
• 3.3.5 展叶期叶籽银杏甲基化水平、模式及位点的差异分析
• 3.3.5.1 展叶期叶籽银杏基因组DNA 的甲基化MSAP 分析
• 3.3.5.2 酶切结果
• 3.3.5.3 预扩增结果
• 3.3.5.4 展叶期叶籽银杏、银杏DNA 胞嘧啶甲基化的水平
• 3.3.5.5 展叶期叶籽银杏、银杏MSAP 扩增图谱构建
• 3.3.5.6 展叶期叶籽银杏、银杏在甲基化模式上的差异
• 3.3.6 叶籽银杏不同组织甲基化水平、模式及差异的分析
• 3.3.6.1 叶籽银杏不同组织甲基化MSAP 分析的酶切结果
• 3.3.6.2 预扩增结果
• 3.3.6.3 叶籽银杏不同组织DNA 胞嘧啶甲基化的水平
• 3.3.6.4 叶籽银杏不同组织MSAP 扩增图谱构建
• 3.3.6.5 叶籽银杏不同组织甲基化模式上的差异
• 3.3.7 叶籽银杏不同单株甲基化水平的分析
• 3.3.7.1 叶籽银杏不同单株胞嘧啶甲基化的水平
• 3.3.7.2 叶籽银杏不同单株MSAP 扩增图谱构建
• 3.3.7.3 叶籽银杏不同单株在甲基化模式上的差异
• 3.4 差异位点回收和二次扩增结果
• 3.5 差异位点片段克隆测序结果
• 3.6 DNA 甲基化差异位点序列分析
• 4 讨论
• 4.1 MSAP 技术体系中常见问题与解决方案
• 4.2 MSAP 分离银杏、叶籽银杏基因组DNA 甲基化修饰位点的有效性及相对性
• 4.3 叶籽银杏基因组甲基化模式的变异
• 4.4 叶籽银杏基因组甲基化组织特异性
• 4.5 叶籽银杏DNA 甲基化与基因表达
• 4.6 叶籽银杏甲基化修饰的系统学意义
• 5 结论
• 5.1 叶籽银杏DNA 胞嘧啶甲基化修饰水平及MSAP 扩增图谱的构建
• 5.2 叶籽银杏EFRO 发育过程中胞嘧啶甲基化具有时空特异性
• 5.3 叶籽银杏不同组织DNA 胞嘧啶甲基化模式上的差异变化
• 5.4 叶籽银杏不同单株DNA 胞嘧啶甲基化差异特点
• 5.5 叶籽银杏修饰位点及多态性位点的同源序列功能注释情况
• 6 参考文献
• 7 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的主要论文
• 博士学位论文内容简介及自评