论文摘要
目的:建立稳定、快速、高通量的人体肠道菌群定量分型方法。方法:采集粪便标本并抽提细菌DNA,利用通用引物扩增细菌的16S rDNA,并进行克隆和测序,用作待检菌的标准品。根据细菌基因数据库,选择球形梭菌群（Clostridium coccoides group）,类杆菌群（Bacteroides and related genera）,柔嫩梭菌群（Clostridium leptum group）三种肠道优势菌的16S rDNA序列,设计相应的连接酶检测反应（ligase detection reaction,LDR）探针。将三种优势菌的克隆标准品用紫外吸收法定量后按比例混匀,PCR扩增16S rDNA后进行LDR检测其信号值,建立标准曲线。将标准品系列稀释后进行PCR及LDR,确定临界值即检测的灵敏度。将临床分离的不同年龄和性别的50份粪便标本,提取细菌总DNA后,经PCR扩增进行16S rDNA的LDR检测,计算标本中三种细菌的相对含量,并用SPSS软件进行分析。结果:利用设计的通用引物对样本的16S rDNA进行克隆及测序,成功建立了标准品和标准曲线,所建立的检测方法最低可检测到10-3飞摩尔/升（fmol/L,fM）。对50份临床收集标本的检测结果显示,球形梭菌群的相对含量随着年龄的增长显著升高（P<0.01）;类杆菌群的相对含量在年龄大于60岁后显著升高（P<0.01）,在青年和中年组间没有差异（P>0.05）;柔嫩梭菌群的相对含量在不同年龄组间均无差异（P>0.05）。三种菌群的相对含量在不同性别之间无差异（P>0.05）。各类人群中均为球形梭菌群最高（46.5±10.8%）,类杆菌群次之（29.3±9.2%）,柔嫩梭菌群最低（24.2±11.5%）,其生物学原因还有待进一步研究。结论:用与质粒载体连接后扩增的克隆作标准品比直接用厌氧菌基因组DNA更简便,可以避免在苛刻条件下重复培养厌氧菌,并可保证后续实验中序列可靠、定量准确。PCR和LDR技术联合使用可实现对多种肠道菌的同时定量,且灵敏度高,是一种简单、快速、稳定、通用和高通量的检测分型方法。对临床分离标本的检测发现三种肠道优势菌群在各类人群中的相对含量以及其与年龄、性别的相关性,但其确切生物学原因有待进一步研究。