合浦珠母贝贝壳形成相关蛋白及基因的研究

论文摘要

生物矿化是矿质结晶在生物的细胞基质或胞外基质中沉积的过程,是自然界中广泛存在的一种现象,对生物有着重要意义。软体动物的贝壳形成是最具代表性的生物矿化过程之一。研究表明,仅占贝壳总重不足5%的有机分子,特别是其中的基质蛋白,在贝壳的生物矿化过程中起着关键调控作用,控制着碳酸钙晶体的形成,同时赋予贝壳许多优异的力学和生物学性能。为进一步揭示贝壳形成的分子机理,本研究以我国培育海水珍珠的最主要贝类——合浦珠母贝（Pinctada fucata）为研究材料,从贝壳蛋白分离纯化与相关基因克隆两方面入手,分离鉴定基质蛋白及其它可能与贝壳形成相关的蛋白和基因,并进一步对其在贝壳形成过程中的地位和作用做了初步的研究。本研究首先从珍珠层中分离获得了一种可溶性基质蛋白p10。体外结晶实验表明,p10能够加速碳酸钙的沉淀并诱导文石晶体的形成,暗示其在碳酸钙晶型决定过程中起着重要作用。同时细胞实验显示,p10能促进成纤维细胞与前成骨细胞向成骨细胞分化,提示其还有可能作用于参与珍珠层形成的细胞。从这些结果来看,p10是一种在合浦珠母贝珍珠层形成过程有着重要作用的多功能蛋白。除了从贝壳中直接分离基质蛋白,本研究还通过设计简并引物,进行RT-PCR和RACE扩增,从合浦珠母贝外套膜中分离鉴定了三种与贝壳形成有关的全长基因,分别编码酪氨酸酶OT47、基质蛋白KRMP家族及肌球蛋白必需轻链。其中,合浦珠母贝酪氨酸酶OT47的基因特异性的表达于外套膜中褶外侧上皮细胞,可能与角质层形成有关,同时表明合浦珠母贝角质层形成可能具有其独特的细胞分泌模式。基质蛋白KRMP家族的基因特异性地表达于外套膜外褶上皮细胞,其信号肽序列也与其它棱柱层基质蛋白信号肽序列有较高的相似性,应为一类棱柱层基质蛋白。同时,序列分析显示KRMP成熟蛋白呈碱性,富含与蛋白交联有关的赖氨酸、酪氨酸和半胱氨酸,提示作用为将具有成核作用的酸性蛋白锚定于棱柱层基质蛋白支架上。此外本研究还分离鉴定了合浦珠母贝肌球蛋白必需轻链基因,其序列比对和表达分析结果将有助于进一步研究合浦珠母贝Ca2+的代谢以及贝壳基质蛋白甚至碳酸钙晶体的分泌机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 生物矿化
• 1.1.1 生物矿化的定义与分类
• 1.1.2 生物矿化的过程与调控机制
• 1.1.3 生物矿化的研究意义
• 1.2 软体动物的贝壳结构与形成
• 1.2.1 软体动物贝壳的结构
• 1.2.2 软体动物双壳类贝壳的形成
• 1.2.3 贝壳形成的其它相关因素
• 1.3 基质蛋白与贝壳的生物矿化
• 1.3.1 文石层特有的基质蛋白
• 1.3.2 方解石层特有的基质蛋白
• 1.3.3 参与整个贝壳矿化的基质蛋白
• 1.3.4 基质蛋白的共同特点
• 1.4 角质层形成与醌单宁蛋白
• 1.5 研究目的与意义
• 1.6 论文各部分主要内容
• 第2章 珍珠层基质蛋白p10 的分离纯化与功能研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 珍珠层可溶性基质蛋白的提取
• 2.2.2 珍珠层可溶性基质蛋白的分离纯化过程
• 2.2.3 SDS-PAGE 电泳
• 2.2.4 BCA 法测定蛋白含量
• 2.2.5 体外碳酸钙结晶实验
• 2.2.6 体外细胞实验
• 2.3 结果
• 2.3.1 合浦珠母贝的珍珠层基质蛋白p10 的分离纯化
• 2.3.2 合浦珠母贝的珍珠层基质蛋白p10 的基本性质
• 2.3.3 合浦珠母贝的珍珠层基质蛋白p10 在碳酸钙结晶中的作用
• 2.3.4 合浦珠母贝的珍珠层基质蛋白p10 对细胞增殖分化的影响
• 2.4 讨论
• 2.4.1 基质蛋白的提取方法
• 2.4.2 p10 在珍珠层形成过程中的作用
• 2.4.3 p10 对于矿化相关细胞的的作用
• 第3章 酪氨酸酶OT47 基因的分离与鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 总RNA 的制备
• 3.2.2 通过RT-PCR 获得基因片段
• 3.2.3 RACE
• 3.2.4 Confirm PCR
• 3.2.5 序列分析
• 3.2.6 基因在不同组织中的表达分析
• 3.2.7 原位杂交
• 3.2.8 酶活性染色
• 3.3 结果
• 3.3.1 合浦珠母贝外套膜总RNA 的完整性
• 3.3.2 合浦珠母贝酪氨酸酶基因的克隆及序列分析
• 3.3.3 序列同源性比较及进化树分析
• 3.3.4 合浦珠母贝酪氨酸酶OT47 基因在外套膜组织中的特异性表达..
• 3.3.5 原位杂交及酶活性染色显示酪氨酸酶OT47 的组织定位
• 3.4 讨论
• 3.4.1 合浦珠母贝酪氨酸酶OT47 的序列特征及进化树分析
• 3.4.2 合浦珠母贝酪氨酸酶OT47 的表达特征
• 第4章 基质蛋白KRMP 家族基因的分离与鉴定
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 总RNA 的制备
• 4.2.2 基质蛋白KRMP 基因的克隆
• 4.2.3 序列分析
• 4.2.4 基因在不同组织中的表达分析
• 4.2.5 原位杂交
• 4.3 结果
• 4.3.1 合浦珠母贝外套膜总RNA 的完整性
• 4.3.2 合浦珠母贝基质蛋白KRMP 基因的克隆及序列分析
• 4.3.3 合浦珠母贝基质蛋白KRMP 基因在外套膜组织中的特异性表达
• 4.3.4 原位杂交显示基质蛋白KRMP 的组织定位
• 4.4 讨论
• 4.4.1 KRMP 的结构特征
• 4.4.2 KRMP 基因的表达特征
• 4.4.3 KRMP 的作用机理
• 第5章 肌球蛋白必需轻链基因的分离与鉴定
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 总RNA 的制备
• 5.2.2 通过RT-PCR 获得基因片段
• 5.2.3 RACE
• 5.2.4 序列分析
• 5.2.5 基因在不同组织中的表达分析
• 5.2.6 原位杂交
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 合浦珠母贝不同组织总RNA 的完整性
• 5.3.2 合浦珠母贝肌球蛋白必需轻链基因的克隆
• 5.3.3 肌球蛋白必需轻链基因同源性比较及系统进化分析
• 5.3.4 合浦珠母贝肌球蛋白必需轻链基因在不同组织中的表达
• 5.4 结论
• 第6章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果