论文摘要
原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球第五位最常见的恶性肿瘤,在全世界肿瘤患者的致死率中高居第三位。我国属HBV感染高发地区,HBsAg携带者发生原发性肝细胞癌的相对危险性比非携带着高200倍,我国原发性肝细胞癌在恶性肿瘤中排位仅次于胃癌,是一种严重威胁生命健康的疾病。同时人们针对肝癌的危险因素进行了大量的流行病学研究,发现代谢综合征与肝癌有密切相关性,甚至可以成为独立的危险因素影响肝癌的发生、发展。手术切除是目前治疗肝细胞癌的首选方法,然而术后复发转移率高,影响了肝细胞癌的疗效。治疗肝癌的关键是早期发现、早期诊断、早期治疗的“三早”原则。要提高肝细胞癌的预后,阻止术后复发转移是重要的一步,因而预见或早期发现肿瘤及其复发转移就显得尤为重要。本课题从两方面分别对影响原发性肝细胞癌发生、发展因素进行阐述。（一）代谢异常与HBV相关的原发性肝细胞癌相关性研究背景:最近研究显示代谢异常可能是乙型肝炎相关性原发性肝细胞癌的一个新的危险因素。但是,目前为止代谢因素与乙型肝炎相关性肝癌之间的相关性尚未得到明确阐述。本课题旨在通过探究代谢异常在乙型肝炎相关性肝癌人群中各代谢指标与肝功能之间的相关性,以明确代谢因素与乙型肝炎相关性肝癌发生发展的关系。方法:本研究收集了179例手术切除且经病理证实为乙型肝炎相关性性肝细胞癌患者为病例组,同期收集100个HBV携带者及150个常规体检的正常人群分别作为对照组。临床实验室肝功能及代谢指标通过日常常规生化及免疫分析仪检测;脂质过氧化产物丙二醛（MDA）及总抗氧化能力（ TAOC）是通过化学分析方法检测。HCC组的体重指数（BMI）从病例资料中获得,分析三组人群肝功能及相关代谢指标之间的差异;HCC组中根据体重指数、糖化血清白蛋白（GA）、游离脂肪酸临界值进行分层分析个指标间的差异,及肝功能及相关代谢指标间的相关性研究。结果:HCC组的体重指数及血糖明显高于对照组,然而血脂却明显低于对照组（P<0.05）;HCC组中通过分层分析得出体重指数越高,胰岛素水平及胰岛素抵抗越高P<0.01);本研究首次发现随着HCC患者血清游离脂肪酸升高,其MDA与GGT也明显升高。HCC组肝功能及代谢指标之间存在显著相关性（P<0.05）。GA水平的升高显著增加了患HCC的风险（OR=9.87,95%可信区间:1.8652.29）。然而,血清甘油三酯及低密度脂蛋白胆固醇水平与HCC的危险性呈负性相关、（OR=0.05,95%可信区间:0.010.27; OR= 0.32, 95%可信区间, 0.110.95）。结论:代谢异常与乙型肝炎相关性病毒之间存在着密切的相关性。氧化应激与脂质过氧化反应可能参与HCC的发病机制或加速肝功能损伤的过程。（二）N-乙酰葡萄糖胺转移酶III与V在原发性肝细胞癌中的生物学功能及意义目的:通过构建GNT-III、GNT-V真核表达质粒并将其导入人肝癌细胞中,获得瞬时表达的细胞株,同时构建GNT-V慢病毒干扰表达载体,稳定转染人肝癌细胞株,分别观察两个基因的表达水平变化对肝癌细胞体外增殖、粘附及侵袭力的影响;检测GNT-III、GNT-V在人原发性肝细胞癌和癌旁周组织中的表达特性及其与肝细胞癌临床特征的相关性,为进一步探讨二者在肝细胞癌侵袭转移中的作用奠定基础。方法:RT-PCR技术获得GNT-III, GNT-V目的片段,基因克隆技术构建pCMV-GNT-III及pEGFP-N1-GNT-V重组真核质粒。脂质体转染方法,将基因导入人肝癌细胞株中;筛选有效的GNT-V RNA干扰靶点,进行慢病毒包装,稳转人肝癌细胞株。RT-PCR方法从mRNA水平鉴定GNT-III及GNT-V的表达。CCK8细胞增殖实验检测GNT-III、GNT-V对细胞增殖能力的影响;基质（Matrigel）粘附实验分析对细胞粘附能力的影响;Transwell体外侵袭实验观察转染后细胞侵袭能力的变化;划痕实验观察转染后细胞迁移能力的变化。选择36例肝细胞癌手术切除标本,荧光定量PCR检测癌组织和癌旁组织GNT-III和的GNT-V的表达;凝集素印迹（Lectin blot）检测癌组织及癌旁组织在原发性肝细胞癌中两个糖基转移酶催化合成的N糖链结构的改变。结果:通过PCR、双酶切及测序鉴定证实已将GNT-III, GNT-V基因cDNA片段正确插入真核表达质粒中,成功构建了pCMV-GNT-III及pEGFP-N1-GNT-V重组真核表达载体;成功构建GNT-V RNAi慢病毒表达载体;脂质体介导的瞬时转染后,经RT-PCR证实转染后细胞高表达GNT-III, GNT-V基因;CCK8细胞增殖实验显示,与转染空载体组相比,转染GNT-V组细胞增殖能力明显增加,具有统计学差异（P<0.05）;细胞-Matrigel基质粘附实验显示,转染GNT-V组细胞基质粘附能力明显增强,差异具有统计学意义（P<0.05）;Transwell侵袭实验中,转染GNT-V组细胞较空载体组,其体外侵袭能力显著升高,差异有统计学意义（P<0.01）。划痕实验揭示转染GNT-V组细胞迁移能力增强,转染慢病毒干扰载体组未见明显的细胞生物学功能的改变。原发性肝细胞癌癌旁组织GNT-III和GNT-V mRNA的表达高于配对癌组织的表达,差异有显著性（P<0.05）;分别结合平分、分支糖链结构的凝集素PHA-E, PHA-L Lectin blot揭示癌旁组织明显高于癌组织;未发现GNT-III、GNT-VmRNA的相对表达量与临床病理因素存在相关性;GNT-V高表达组存在复发率降低、无瘤生存期延长趋势,但是没有统计学差异（P>0.05）。结论:成功获得重组真核质粒pCMV-GNT-III, pEGFP-N1-GNT-V和瞬时表达GNT-III及GNT-V基因的肝癌细胞,为后续体外实验研究GNT-III对人肝癌细胞增殖、粘附和迁移能力的影响奠定基础;体外实验表明GNT-V过表达可增强肝癌细胞增殖、粘附和迁移能力;原发性肝细胞癌癌旁组织组织GNT-III, GNT-V的mRNA水平的相对表达量高于其配对的癌组织。
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