φC31整合酶介导的外源基因在牛基因组中整合位点的分析与应用

论文摘要

φC31整合酶是在φC31链霉菌（Streptomyces）噬菌体中发现的,可介导噬菌体在细菌基因组中发生位点特异性整合的重组酶。它同样能在哺乳动物细胞中介导携带有34bp attB序列的外源载体与基因组上的某些特定位点发生特异性整合,基因组上的该位点被称为假attP位点,其与噬菌体attP位点存在着一定的同源性。假attP位点广泛存在于多种物种的基因组中,而且每个物种往往存在着多个假attP位点。进一步的研究还发现,在人、小鼠中某些假attP位点能高频率地被整合,而且整合在该位点的外源基因还能高效表达。本文在先前发现的两个牛假attP位点BpsF1、BpsM1的基础上,继续对牛基因组中能介导外源基因高效整合并高水平表达的假attP位点进行研究。本研究首先利用φC31整合酶介导绿色荧光蛋白基因对牛耳皮肤成纤维细胞进行稳定转染,并筛选出两个分别显示绿色荧光蛋白较强和较弱的克隆,接着用反向PCR的方法对GFP基因在基因组中的整合位点进行扩增。结果表明,在这两个细胞克隆中,外源载体均在attB序列的核心位置与牛基因组发生整合,说明其发生了位点特异性重组,染色体上的整合位点称为牛基因组假attP位点。扩增出的序列经BLAST比对发现,在绿色荧光蛋白表达较强和较弱的两个细胞克隆中,假attP位点分别位于牛的4号染色体（NW001494928）以及10号染色体上（NW001492885）,我们将其命名为BF4、BF10位点。对这两个假attP位点的序列分析表明与先前发现的两个位点BpsF1、BpsM1一样,BF4、BF10位点均不在编码区。同时我们还运用了荧光原位杂交（FISH）技术对这两个假attP位点在牛染色体上进行定位,结果显示BF4位点位于染色体的4q31区,BF10位点位于染色体的10q35区,与比对的结果相吻合。接着,我们对这四个牛假attP位点的整合频率以及分别整合在BF4、BF10位点上的外源基因的表达情况进行研究。结果显示在共57个独立的细胞克隆中有42个整合于BF4位点上,占74%（42/57）,而整合于BF10、BpsF1位点的细胞克隆分别占7%（4/57）。另外,没有发现整合于BspM1位点的细胞克隆。该结果清楚地表明,φC31整合酶介导的外源基因在牛基因组中的整合并不是随机的,而且整合位点的选择明显地偏好于BF4位点,即BF4位点为整合热点。通过显微镜观察、ELISA、FACS以及Western Blot的分析,都显示在BF4位点上整合的GFP蛋白表达水平明显高于BF10位点。ELISA检测整合于BF4位点上的GFP水平为328μg/mg,是整合于BF10位点上的基因表达水平（135μg/mg）的2倍以上。该研究结果与在人、小鼠基因组中存在的热点位点特征相类似,即整合于热点位点的外源基因均能得到高效地表达。这样,我们在牛基因中发现了一个能被高频地介导整合,而且能促进外源基因高效表达的假attP位点。最后,为了进一步提高外源基因分别整合在BF4或BF10位点上的频率,我们作了进一步探索,在表达绿色荧光蛋白的载体上分别加入BF4或BF10位点的旁侧序列,构建成插入型同源重组载体,并在线性化位点上引入attB序列,试图联合利用φC31整合酶介导的位点特异性重组以及同源重组机制促进外源基因以更高的频率整合于目的位点。实验结果表明,这种经过改造的定向载体能够提高外源基因在目的位点的整合率,提高水平达20-50%,其中整合于BF4位点的细胞克隆占93%,而且整合于BF4位点的外源基因依然维持高效表达。本研究结果对应用体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）技术进行转基因动物的生产提供了一条有效的途径。它可极大地提高我们对转基因细胞的选择效率,降低筛选的盲目性。比如,通过对带有attB序列的外源载体与表达φC31整合酶的载体共转染的阳性细胞克隆进行整合位点分析,整合于BF4位点的细胞克隆即可作为核供体或直接将共转染的高整合率阳性细胞克隆作为核供体,用于下一步的核移植,进而制备转基因动物,可大大提高转基因的效率和表达水平。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 参考文献
• 1 在牛基因组中两个假attP 位点的发现
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 参考文献
• 2 不同位点的整合频率以及外源基因的表达水平分析
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 3 利用假attP 位点进行载体构建及其整合频率与表达水平的分析
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 结论
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 附录4
• 附录5
• 附录6
• 致谢
• 攻读学位期间发表的文章及申请的专利