内含子对烟草铁蛋白基因功能影响的研究

论文摘要

用农杆菌介导法将克隆的烟草铁蛋白基因组基因InFer1转入烟草,获得T0代转基因烟草种子。对T1代转烟草铁蛋白基因组基因InFer1和铁蛋白cDNA基因NtFer1的卡那霉素抗性分析表明,整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因,也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到烟草基因组,并且表达正确。将转基因株系栽于100μmol/LFe2+和300μmol/L Fe2+浓度的MS培养基中,生长1个月后进行比较表明,转基因烟草和非转基因烟草的株高、鲜重、叶绿素相对含量、MDA活性、POD活性、SOD活性和叶片铁含量相比存在明显差异:在300μmol/L Fe2+条件下,转NtFer1基因烟草的长势明显优于转InFer1基因烟草和非转基因烟草;转InFer1基因烟草的MDA含量比转NtFer1基因烟草低,而SOD活性与MDA含量的变化趋势相反;在100μmol/L Fe2+和300μmol/L Fe2+浓度的MS培养基中转NtFer1基因烟草叶片铁含量分别高于转InFer1基因烟草19.7%和21%,高于非转基因烟草22%和8.1%,且差异达到显著水平。在盆载条件下,45d后转InFer1基因烟草光合作用速率、蒸腾作用速率和叶片气孔导度平均值分别比转NtFer1基因烟草和非转基因烟草高11%和5.7%、49.7%和163%、68.2%和79.8%;且差异达到显著水平。在100μmol几和300μmol/L Fe2+条件下烟草铁蛋白基因内的内含子具有抑制烟草铁蛋白基因过量表达的作用;在300μmol/L Fe2+条件下具有提高叶片SOD活性和降低MDA氧化基团的含量的作用,从而降低氧化基团对叶片膜系统的伤害。在盆载条件下烟草铁蛋白基因的内含子有促进烟草叶片光合作用和蒸腾作用功能,并且能够增强气孔导度。运用同样的方法将铁蛋白基因组基因InFer1导入杨树基因组中,对转基因杨树进行了PCR、PCR-Southern检测检测表明InFer1基因已整合到杨树基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 内含子研究进展
• 1.1.1 内含子概念
• 1.1.2 内含子的分类
• 1.1.3 内含子的剪接
• 1.1.4 内含子的功能
• 1.1.5 小结
• 1.2 铁蛋白及其基因研究概况
• 1.2.1 铁元素在生物体内的作用
• 1.2.2 铁蛋白结构和功能
• 1.2.3 铁蛋白基因研究进展
• 1.3 植物转基因技术研究进展
• 1.3.1 转基因技术的发展
• 1.3.2 根癌农杆菌介导的遗传转化
• 1.3.3 转基因技术在林业生产中的应用
• 1.3.4 转基因杨树的研究价值
• 1.4 研究展望
• 2 烟草铁蛋白基因组基因InFer1植物表达载体构建及对烟草的遗传转化
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 酶和试剂
• 2.1.5 引物序列设计
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 铁蛋白基因组基因InFer1的克隆
• 2.2.2 InFer1基因连入pMD18-T载体
• 2.2.3 InFer1基因转入大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.4 重组体鉴定
• 2.2.5 植物表达载体的构建
• 2.2.6 表达载体转入农杆菌
• 2.3 铁蛋白基因组基因InFer1对烟草的遗传转化
• 2.3.1 烟草无菌组培苗获得
• 2.3.2 根癌农杆菌介导的烟草的遗传转化
• 0代转基因烟草的PCR检测'>2.3.3 T₀代转基因烟草的PCR检测
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 目的基因片段的获得和序列分析
• 2.4.2 对植物表达载体pBI121的改造
• 2.4.3 重组植物表达载体PCR检测
• 2.4.4 重组农杆菌PCR检测
• 0代转基因烟草的PCR扩增结果'>2.4.5 T₀代转基因烟草的PCR扩增结果
• 2.5 讨论与小结
• 2.5.1 InFer1和NtFer1基因序列分析讨论
• 2.5.2 烟草叶片处理对转化后再生的影响
• 2.5.3 菌类的抑制
• 2.5.4 本章小结
• 1）检测分析'>3 转基因烟草子一代（T₁）检测分析
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.2 培养基
• 3.3 转基因烟草子一代（T1）的遗传分析
• 3.3.1 试验材料的处理
• 3.3.2 转基因烟草的遗传分析
• 3.4 转基因烟草子一代（T1）的分子检测分析
• 3.4.1 PCR-Southem杂交检测分析
• 3.4.2 Northern杂交检测分析
• 3.5 本章小结
• 4 烟草铁蛋白基因内含子功能分析
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 试验方法
• 1）转基因烟草组培苗的培育'>4.2.1 子一代（T₁）转基因烟草组培苗的培育
• 4.2.2 生理指标测定方法
• 4.2.3 结果比较分析
• 4.2.4 本章小结
• 4.2.5 本章讨论
• 5 InFer1基因对山新杨的遗传转化和检测
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 菌株和质粒
• 5.1.3 转基因山新杨遗传转化培养基
• 5.1.4 酶和试剂
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 InFer1基因植物表达载体构建
• 5.2.2 根癌农杆菌介导的山新杨的遗传转化
• 5.2.3 转基因杨树DNA的提取、PCR、PCR-Southern方法同烟草
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 转基因杨树的PCR与PCR-Southern检测
• 5.4 小结与讨论
• 5.4.1 本章小结
• 5.4.2 关于转基因杨树转化的讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢