论文摘要
雷帕霉素是一种大环内酯类抗生素。由于雷帕霉素被发现能够抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和迁移,故被广泛用于药物涂层支架（DES）,从而防止冠状动脉支架植入术后的血管腔再狭窄。然而一个不容忽视的问题是,近来一些临床研究结果显示,与裸金属支架相比,接受雷帕霉素涂层支架植入的患者具有更高的支架内晚期血栓（LST）发生率。产生这一现象的原因被认为是雷帕霉素除了能够抑制VSMC的增殖和迁移外,同样可以抑制血管内皮细胞（VEC）的增殖和迁移能力,从而导致支架丝内皮覆盖不全,进而引起LST。尽管一些方法如延长双联抗血小板治疗、他汀治疗等提示可以改善LST的发生,但其效果、费用及安全性仍不完善。已有一些研究就雷帕霉素抑制VEC的机制做了探讨。雷帕霉素靶点复合物1（mTORCl）,是由哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）, mTOR调控相关靶蛋白（Raptor）, G蛋白β样蛋白（GβL）三者构成；而mTORC2则由雷帕霉素非敏感mTOR伴侣（Rictor）与mTOR、GβL构成。现有研究发现,一旦与FKBP12结合,雷帕霉素可以直接抑制mTORC1信号通路,进而导致细胞转录、核糖体合成和信号翻译进程的全面停滞,使得内皮细胞周期停止于G0/G1期。mTORC2控制细胞骨架运动,曾一度被认为是雷帕霉素非敏感的。然而近来研究表明,雷帕霉素同样可以抑制mTORC2信号通路,长时间雷帕霉素处理（>24h）可以通过mTORC2-p27kip信号通路抑制内皮细胞迁移。尽管这些研究似乎给出了雷帕霉素抑制内皮细胞增殖和迁移机制的答案,随着时间的推移,更新更深入的机制开始进入我们的视野。微小RNA （microRNA, miR）是一类内源性非编码小RNA,长度一般在19-22个碱基范围内。miR通过与靶基因3’端非编码区域（UTR）结合,降解或抑制靶基因mRNA翻译效率,从而在基因转录水平广泛发挥负性调控的作用。已有报道表明,miR在内皮细胞功能方面扮演着十分重要的角色,诸如增殖、迁移、成血管、凋亡等重要的内皮细胞功能方面,miR均广泛参与。除此以外,越来越多的证据表明,miR与mTORC各成员间也存在调控关系。Uesugi等报道,在口腔癌细胞中,miR-218可作用于Rictor蛋白；Chen等发现在血管内皮细胞中,miR-101介导了层流应切力导致的mTOR蛋白水平下调。这些miR与mTORC成分间的互动关系提示miR可能参与了雷帕霉素对内皮细胞功能的调节。因此,我们提出这一假设：雷帕霉素抑制血管内皮细胞增殖和迁移能力,部分可能通过miR途径实现。研究这一具体机制可进一步深入揭露雷帕霉素作用的机制,并为临床上解决LST这一难题提供新的解决思路。本研究中,我们首先观察了雷帕霉素对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和迁移功能的影响,并筛选出雷帕霉素作用下表达水平显著变化的miR；其次我们研究了该筛选出来的miR在雷帕霉素诱导的HUVEC增殖和迁移抑制中的作用及其机制。以下分两部分对本研究的方法、结果及结论作一简述。1雷帕霉素对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移功能的影响及其作用下人脐静脉内皮细胞microRNA的表达差异目的：观察雷帕霉素对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移功能的影响,挑选出雷帕霉素抑制内皮细胞增殖、迁移的最佳作用浓度和时间,观察该作用浓度及时间下HUVEC microRNA表达差异并验证确认。方法：培养并扩增HUVEC细胞系,采用1-1000ng/ml雷帕霉素分别作用12-72h,分别用CCK-8试验、EDU吸收试验检测HUVEC增殖能力,划痕实验、改良的Boyden小室迁移试验检测HUVEC迁移能力。检索Pubmed,选择与内皮细胞（EC）增殖与迁移能力有关的miR, qRT-PCR array法筛选雷帕霉素作用下表达水平显著变化的miR,进一步qRT-PCR法验证。结果：CCK-8及EDU吸收实验证实雷帕霉素可剂量时间依赖性地抑制HUVEC增殖,以100ng/ml作用24小时最为显著。划痕实验、改良的Boyden小室迁移试验证实雷帕霉素处理24小时可剂量依赖性的抑制HUVEC迁移能力。qRT-PCR array检测显示100ng/ml雷帕霉素作用24小时可上调miR-21水平。进一步qRT-PCR验证显示miR-21上调与雷帕霉素呈时间剂量依赖性,并于100ng/ml和24h达到峰值。结论：雷帕霉素可抑制HUVEC增殖和迁移能力,并可时间和剂量依赖性地上调HUVEC miR-21水平。2miR-21在雷帕霉素诱导的人脐静脉内皮细胞增殖和迁移抑制中的作用及机制目的：观察miR-21在雷帕霉素诱导的HUVEC增殖和迁移抑制中的作用,并探讨其作用机制。方法：采用miR-21模拟物或抑制剂转染HUVEC从而上调或下调细胞内miR-21水平,分别采用CCK-8试验、EDU染料吸收试验检测HUVEC增殖能力,划痕实验、改良的Boyden小室迁移试验检测HUVEC迁移能力。采用生物信息学方法,检索miR-21作用的可能靶基因,并进一步使用qRT-PCR、western blot及构建包含特定靶基因3’-UTR序列及突变序列的双荧光素酶报告载体质粒与miR-21模拟物共转染293T细胞,验证该基因是否为miR-21靶基因。使用siRNA技术分别下调Raptor和Rictor蛋白,观察其下调是否影响miR-21的表达。结果：使用miR-21抑制剂下调其表达可恢复雷帕霉素抑制的HUVEC增殖和迁移能力,miR-21模拟物可进一步抑制HUVEC增殖和迁移能力,但与雷帕霉素单独处理组相比较无统计学差异。生物信息学检测提示RhoB是miR-21的靶基因。qRT-PCR、western blot检测及双荧光素酶报告载体实验证实RhoB是miR-21的靶基因。Raptor下调可促进miR-21表达,Rictor siRNA不改变miR-21水平。结论：miR-21下调可逆转雷帕霉素抑制HUVEC增殖和迁移的作用,RhoB是miR-21的靶基因,雷帕霉素上调miR-21可能是其抑制Raptor的结果。