黄河中游地区粗山羊草遗传多样性、高分子量谷蛋白亚基基因的克隆及纹枯病抗性分析

论文摘要

粗山羊草（Aegilops tauschii, 2n = 2x = 14,DD）是六倍体普通小麦D基因组的供体种,由于仅有特定区域的少数粗山羊草基因型参与了普通小麦的起源,其遗传变异类型远比普通小麦D染色体组丰富。我国黄河中游地区自然分布着粗山羊草,但对其系统收集及规模性深入研究尚未见报导。本研究利用SSR标记比较了我国黄河中游（河南、陕西）粗山羊草与新疆、中东粗山羊草的多样性及遗传分化状况,并针对黄河中游居群粗山羊草的高分子量谷蛋白亚基（high molecular weight glutenin subunit, HMW-GS）的组成、克隆及纹枯病抗性进行了系统研究。（1）选用分布在粗山羊草14条染色体上的32对SSR引物,对来自中国河南、陕西、新疆和中东地区共147份粗山羊草材料进行遗传分化及多样性分析,结果表明在26个多态性位点中,等位基因数平均为4.15,Nei基因多样性指数（He）平均为0.243,多态性信息含量指数（PIC）平均为0.226;居群间遗传变异差异明显,中东粗山羊草居群具有丰富的遗传变异（He =0.607,PIC =0.551）,而来自陕西和河南的粗山羊草资源遗传多样性较低（He =0.055,PIC =0.047）和（He =0.024,PIC =0.021）。AMOVA分子变异分析显示,居群间遗传变异占总变异的52%,达到显著水平;河南粗山羊草和陕西粗山羊草间发生了一定的遗传分化（Fst =0.210）,为研究黄河中游粗山羊草资源的起源与分化问题提供了有用的信息与证据,并为小麦品质改良育种提供丰富的遗传资源。（2）利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术分析了黄河中游地区161份粗山羊草的HMW-GS,发现3种编码序列未知的y-型亚基,即Dy10.5t、Dy10.4t和Dy10.5*t亚基。通过AS-PCR扩增、克隆、测序和氨基酸序列推导,发现3种未知序列均具有典型HMW-GS的序列结构特征且较为相似,仅Dy10.4t与Dy10.5t亚基存在一个氨基酸重复单元的缺失,Dy10.5t与Dy10.5*t亚基在信号肽部位有一个氨基酸的替换（L-F）。通过对这3种HMW-GS体外表达及与32个已知氨基酸序列的HMW-GS多序列比对和系统进化关系分析,证实Dy10.5t、Dy10.4t和Dy10.5*t 3个亚基是D基因组编码的高分子量谷蛋白y-型亚基家族的新成员,同时为研究小麦族的起源和进化提供有用的信息和证据。深入研究黄河中游地区粗山羊草HMW-GS,特别是对其编码基因的测序,对于进一步研究其结构功能以及在小麦品质改良中的应用具有非常重要的意义。（3）利用改进的纹枯病菌接种法,于2007-2008年两个小麦种植年度,对我国黄河流96份粗山羊草材料纹枯病抗性进行田间鉴定,结果显示,稳定表现近免疫（I）的材料28个,高抗（HR）材料37个,中抗（MR）材料30个,仅SX-6表现中感（MS）。并根据所有供试材料在不同生长期和不同年份的相对抗病指数,对所调查的材料进行抗性多样性聚类分析,综合分析得出共有76份材料表现为较强的纹枯病抗性,是我国小麦改良育种很好的纹枯病菌抗源。系统地调查黄河中游地区粗山羊草的纹枯病特性,从中筛选出的抗性种质为小麦的改良提供了抗源材料。

论文目录

• 缩写词表
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦的起源与进化
• 1.2 粗山羊草资源研究状况
• 1.2.1 粗山羊草的分类地位及分布
• 1.2.2 粗山羊草的优异性状
• 1.2.3 粗山羊草优异基因在小麦遗传改良中的应用
• 1.2.3.1 直接途径
• 1.2.3.2 间接途径
• 1.2.4 粗山羊草遗传多样性及遗传标记的研究进展
• 1.2.4.1 形态学标记
• 1.2.4.2 细胞学标记
• 1.2.4.3 同工酶标记
• 1.2.4.4 DNA 分子标记
• 1.3 籽粒高分子量谷蛋白研究进展
• 1.3.1 高分子量谷蛋白亚基的遗传
• 1.3.2 高分子量谷蛋白亚基的鉴定
• 1.3.2.1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.3.2.2 免疫化学技术
• 1.3.2.3 分子标记技术
• 1.3.3 HMW-GS 多样性
• 1.3.3.1 小麦HMW-GS 多样性
• 1.3.3.2 粗山羊草HMW-GS 多样性
• 1.3.4 高分子量谷蛋白亚基的品质效应
• 1.3.5 HMW-GS 的氨基酸序列与结构特征
• 1.3.5.1 HMW-GS 的一级结构特征
• 1.3.5.2 HMW-GS 空间结构特征
• 1.3.6 粗山羊草HMW-GS 基因的分子克隆
• 1.4 小麦纹枯病抗性研究进展
• 1.4.1 症状与病原菌
• 1.4.2 发病规律及其影响因素
• 1.4.3 抗病机理
• 1.4.4 抗性鉴定方法
• 1.4.5 抗性遗传与抗病育种
• 1.4.5.1 抗源筛选与改良
• 1.4.5.2 抗病性遗传
• 1.5 本研究的立题依据及意义
• 第二章 粗山羊草居群间遗传分化及多样性的SSR 分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验仪器与试剂
• 2.1.3 基因组DNA 提取
• 2.1.4 SSR 分析
• 2.1.4.1 SSR 扩增
• 2.1.4.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染程序
• 2.1.4.3 数据处理
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 SSR 位点多样性
• 2.2.2 居群内遗传变异
• 2.2.3 居群间遗传分化
• 2.2.4 聚类分析
• 2.3 讨论
• 第三章 黄河中游地区粗山羊草3 种y-型高分子量谷蛋白亚基的鉴定、克隆及系统进化分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 高分子量谷蛋白亚基组成分析
• 3.1.3.1 麦谷蛋白的提取
• 3.1.3.2 SDS-PAGE 鉴定
• 3.1.3.3 基因命名
• 3.1.4 总基因组DNA 的提取
• 3.1.5 高分子量谷蛋白亚基的克隆
• 3.1.5.1 主要试剂
• 3.1.5.2 AS-PCR 扩增
• 3.1.5.3 连接反应
• 2 法）'>3.1.5.4 大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞的制备（CaC1₂法）
• 3.1.5.5 转化
• 3.1.5.6 阳性克隆的挑选与鉴定
• 3.1.5.7 序列测定与拼接
• 3.1.6 高分子量谷蛋白新亚基编码基因的原核表达
• 3.1.6.1 引物设计
• 3.1.6.2 PCR 扩增及与表达载体的连接
• 3.1.6.3 连接产物的转化及重组质粒表达载体的鉴定
• 3.1.6.4 原核表达与检测
• 3.1.7 序列比对、系统进化分析和翻译后修饰、二级、三级结构的预测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 黄河中游地区粗山羊草高分子量谷蛋白组成
• 3.2.2 3 种y-型亚基的分子克隆与序列分析
• 3.2.3 3 种y-型亚基的体外表达
• 3.2.4 与已知HMW-GS 亚基编码基因的序列比对和系统进化分析
• 3.2.5 3 亚基翻译后修饰的预测
• 3.2.6 HMW-GS 二级结构、三级结构预测
• 3.3 讨论
• 第四章 黄河中游地区粗山羊草纹枯病抗性评定及多样性分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 抗纹枯病鉴定
• 4.1.2.1 纹枯病菌的培养
• 4.1.2.2 田间抗病性鉴定
• 4.1.2.3 抗病性评价
• 4.1.2.4 抗性多样性分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 纹枯病的抗（耐）病性鉴定与差异分析
• 4.2.1.1 粗山羊草在拔节孕穗期对纹枯病的抗（耐）病性
• 4.2.1.2 粗山羊草在扬花灌浆期对纹枯病的抗（耐）病性
• 4.2.2 抗性多样性分析
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢