论文摘要
在真核细胞中,遗传物质的准确分离由双极化的纺锤体结构完成。纺锤体由反相平行的微管结构组成,负端集中在纺锤体两极（Spindle pole）,正端与动粒（Kinetochore）相连接排列在纺锤体赤道面。整个细胞分裂过程是通过纺锤体丝与染色体着丝点的协同作用来完成。正确的微管组织、纺锤体的组装和染色排列是细胞健康的保证,纺锤体组装和染色体排列的异常导致的细胞生长失控是癌症发生的重要分子机制。微管的组织、纺锤体的组装及染色体的分离需要大量的蛋白质的参与,其中包括马达蛋白和非马达蛋白。参与有丝分裂的马达蛋白可通过ATP酶的作用,将能量转化为动力,在微管上运动产生力或者控制微管的动态性来参与纺锤体的组装。非马达蛋白则可通过稳定和组织微管、协助微管成核、调节马达蛋白活性以及微管的动态性、调节纺锤体的形状和大小等机制来调控染色体分离和细胞周期的进程。核有丝分裂器蛋白NuMA是一种大分子的非马达蛋白,在细胞分裂间期,NuMA位于细胞核内,细胞分裂开始后,NuMA与马达蛋白Dynein及其配体Dynactin组成复合物,在Dynein/Dynactin的协同作用下,NuMA逐渐向纺锤体两极移动,在细胞分裂中期（Metaphase）, NuMA集中于纺锤体两极,通过组织和稳定微管、维持纺锤体微管在纺锤体极的集束在细胞分裂过程中发挥重要的作用。大量研究显示在细胞周期进程中,NuMA可与很多马达蛋白、非马达蛋白、结构蛋白、蛋白激酶等相互作用,等形成一个复杂的蛋白质调控网络,在细胞周期、细胞有丝分裂过程中通过参与微管组织、纺锤体组装、染色体排列和细胞周期调控等过程发挥重要作用,但其详细的分子机制尚不清楚。目前NuMA的研究仍然是细胞生物学、分子生物学、发育生物学、肿瘤生物学特别是细胞周期、细胞分裂等领域的热点研究对象。为了深入研究核有丝分裂器蛋白NuMA在哺乳动物细胞有丝分裂过程中的功能及分子机制,我们运用酵母双杂交系统筛选到了一个新的可能与NuMA相互作用的纺锤体相关蛋白:Astrin（Aster-associated protein）。为了验证酵母双杂交的结果,我们运用免疫共沉淀（Co-IP）、GST-Pulldown生物化学实验方法分别从体内水平（in vivo）和体外水平（in vitro）证实NuMA和Astrin能够相互作用,而且NuMA和Astrin的相互作用是通过直接结合而非其他媒介间接完成的。我们进一步利用酵母双杂交系统及Co-IP生化实验方法详细分析了NuMA和Astrin蛋白相互作用的分子位点,确认NuMA和Astrin相互作用位点都位于C端。为了了解NuMA和Astrin两种蛋白在哺乳动物细胞生长周期是否存在相互作用的条件,我们运用免疫荧光的方法,分别观察了NuMA和Astrin在HeLa细胞中的亚细胞定位和共定位情况,结果显示在细胞分裂间期,NuMA位于细胞核内而Astrin位于细胞浆内,二者无共定位。从细胞有丝分裂期开始,核膜破裂后,Astrin和NuMA共定位于纺锤体。在细胞分裂中期,Astrin和NuMA共定同集中于纺锤体两极,Astrin和NuMA的共定位一直持续到细胞分裂后期,直至细胞分裂结束。作为一个非微管结合蛋白,Astrin在细胞有丝分裂中的纺锤体微管定位机制尚不清楚。我们利用荧光免疫影像技术外源性过量表达NuMA和Astrin,观察NuMA和Astrin在细胞中的相互作用情况。我们的研究证实NuMA可以辅助Astrin定位于微管,结果说明Astrin在细胞有丝分裂期的纺锤体定位可能与NuMA相关。为了了解NuMA和Astrin在哺乳动物细胞内相互作用的功能和分子机制,我们利用RNA-基因沉默技术（（?）Knock-down）和外源性基因过量表达（over-expression）技术干扰内源性NuMA的正常功能,观察NuMA的功能缺失（loss of function）对Astrin的细胞定位及对细胞周期进程及纺锤体活动的影响。结果显示内源性NuMA的降低可导致Astrin在有丝分裂纺锤体、纺锤体极和动粒的降低。我们还运用外源性过量表达LGN抑制NuMA和Astrin的相互作用,结果与内源性NuMA的敲除相似,外源性过表达的LGN的细胞,包括纺锤体极、纺锤体极动粒上的Astrin均大幅降低。少数LGN高表达的细胞,Astrin抑制明显,纺锤体上的Astrin几乎无法检测。NuMA Knock-down和过量表达LGN的结果共同说明,细胞有丝分裂期,Astrin的纺锤体和纺锤体极的定位是通过NuMA的辅助完成的。为了研究NuMA的分布是否依赖于Astrin,我们利用RNA-i基因沉默技术和外源性基因过量表达技术分别干扰内源性Astrin表达和功能,结果显示NuMA在纺锤体上的分布不直接依赖于Astrin,但Astrin的敲除可通过影响微管-动粒的连接稳定间接影响NuMA在纺锤体极的聚集。Astrin的一个独特之处在于它在细胞分裂期具有两个分布池：纺锤体极和动粒,在细胞分裂的不同时期, Astrin在两个分布池呈动态分布。为了深入研究NuMA对Astrin在细胞有丝分裂期动态分布的影响,我们运用shRNA敲除动力蛋白Dynein,以此抑制NuMA在纺锤体极的聚集,结果显示Dynein的敲除导致纺锤体极的Astrin显著下降,而Astrin在动粒的分布则有所增强。而过量表达NuMA片段则能够降低Astrin在动粒的分布。以上实验证实Astrin在纺锤体极的聚集是通过动力蛋白Dynein的运输完成的,同时NuMA可平衡Astrin在纺锤体极和动粒两个分布池之间的动态分布。作为两种重要的非马达蛋白,NuMA和Astrin在细胞有丝分裂期相互作用,并与其他马达蛋白、非马达蛋白一起组成一个相互影响、相互依赖、相互配合的分子调控网络。在细胞周期的不同阶段,在纺锤体的不同部位动态分布,在细胞有丝分裂、纺锤体的组装、微管的组织、微管和动粒的稳定、染色体的排列、细胞周期的调控等过程中发挥了重要作用。
论文目录
相关论文文献
标签：核有丝分裂器蛋白论文; 星状体相关蛋白论文; 蛋白质蛋白质相互作用论文; 微管论文; 纺锤体论文; 细胞周期论文; 有丝分裂论文;