鸡Lpin2基因的时空表达特性及其遗传变异与性状的关联分析

论文摘要

Lpin2作为lipin家族（lipin1,Lpin2和lipin3）一员,是调控脂肪细胞发育及甘油三酯在脂肪细胞中沉积的关键基因。目前,Lpin2基因的研究主要集中在人、鼠和猪上,我们仅能在数据库上搜索到预测的鸡Lpin2基因mRNA序列,尚未见任何相关的研究报道。本研究进行了鸡Lpin2基因的转录产物的克隆、基因组结构分析、时空表达特性及其多态性与固始鸡资源群脂肪性状的关联研究。采用EST数据库搜索和RT-PCR相结合的方法获得了鸡Lpin2基因大致的cDNA序列,其长度约为3269bp,包含2664bp的CDS、176bp的5’UTR和429bp的3’UTR。CDS序列预测编码887个氨基酸蛋白,与人、鼠、猪和爪蟾属Lpin2的相似性分别为74.35%、74.67%、72.94%和69.73%,与Lpin1基因的相似性为54%。通过生物信息学分析,校正了鸡Lpin2基因组结构,结果显示鸡Lpin2基因编码序列跨越49kb,包含20个外显子,19个内含子,全部的第一外显子和大部分的第20外显子为非编码区,分别为5’UTR和3’UTR序列。为了检测鸡Lpin2基因在不同组织中的表达差异,本试验以成年黑羽鸡（地方鸡杂交品种）为研究对象,分别采用半定量PCR检测鸡总Lpin2基因在脑、心脏、肝脏等15个组织中mRNA的相对含量。结果显示,在所有组织中都可以检测到该基因的表达,在脑、心、肝、脾、肺、肾、卵巢中有较高的表达水平,在肌胃、小肠、腹脂、皮肤、皮脂、胸肌中表达量较低,在胰腺和腿肌中表达量最低。之后又通过TaqMan实时定量PCR进行绝对定量,结果显示,鸡Lpin2基因分别在卵巢和肝脏中表达量最高,显著高于其它组织（p<0.05）,在胸肌和腿肌中表达量最低,与半定量结果基本相符,但在两个体重显著差异的黑羽鸡和麻羽鸡间差异不显著。此外,我们以不同周龄的丝毛乌骨鸡为研究对象,利用TaqMan荧光探针法还检测了鸡Lpin2基因在不同生长发育时期的表达量差异,结果显示,肝脏、皮肤和肌肉三个组织中Lpin2mRNA水平都是在0周龄时最高,其中0周龄肌肉中Lpin2 mRNA水平显著高于4和16周龄（p<0.05）,从同一周龄不同组织来看,12周龄、16周龄肝脏的Lpin2 mRNA水平分别显著（p<0.05）和极显著（p<0.01）地高于皮肤和肌肉。本研究在验证Lpin2 CDS过程中,通过直接测序法在乌鸡、肉鸡、黑鸡和麻鸡这四个品种中发现15个变异位点,其中分别位于Exon4和13上的c.444G>A和c.1730A >T变异位点引起了酶切位点和编码氨基酸的改变;另外,启动子区域的测序结果也发现一个c.-599G>A变异。因此,根据这三个位点设计引物,采用PCR-RFLP方法检测它们在不同品种和固始鸡资源群的分布情况,并进行了性状关联分析。研究发现Lpin2基因的这三个多态位点与肝脏、皮脂重、皮脂率、肌间脂肪宽度及血液中合成脂类的前体物质甘油三酯和低密度脂蛋白含量显著相关（p<0.05）。本研究为进一步研究鸡Lpin2基因的功能及阐明鸡脂肪沉积的分子机理奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 Lpin2 基因国内外研究现状及分析
• 1.1.1 Lpin2 基因与脂肪沉积的关系
• 1.1.2 Lpin2 基因在人上的研究
• 1.1.3 Lpin2 基因在鼠上的研究
• 1.1.4 Lpin2 基因在猪上的研究
• 1.1.5 Lpin2 与 Lpin1 基因的差异和关
• 1.1.6 鸡体脂肪的代谢及肝脏代谢的功能
• 1.1.7 鸡Lpin2 基因的初步分析
• 1.2 荧光定量 PCR 技术研究进展
• 1.2.1 荧光定量PCR 的定义
• 1.2.2 荧光定量PCR 定量原理
• 1.2.3 常用的荧光定量PCR 仪
• 1.2.4 荧光探针的种类及其作用原理
• 1.2.5 荧光定最PCR 技术的优点
• 1.2.6 荧光定量PCR 技术的应用
• 1.3 单核苷酸多态性
• 1.4 CRS-PCR-RFLP 技术
• 1.5 研究的目的和意义
• 2、鸡Lpin2 基因转录产物的克隆及基因组结构分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验动物
• 2.2.2 主要试剂以及配制
• 2.2.3 主要仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 PCR 引物设计与合成
• 2.3.2 提取各个组织中的总RNA
• 2.3.3 RNA 检测
• 2.3.4 反转录反应
• 2.3.5 PCR 反应
• 2.3.6 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.3.7 胶回收和测序
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 各组织总RNA 的提取
• 2.4.2 用持家基因 β-actin 引物进行 RT-PCR 检测各组织 cDNA 的质量
• 2.4.3 Lpin2 基因的克隆及基因组结构分析
• 2.5 讨论与结论
• 2.5.1 鸡Lpin2 基因结构的研究现状
• 2.5.2 鸡Lpin2 基因与其它物种的同源性分析
• 3、鸡Lpin2 基因时空表达特性分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验动物
• 3.2.2 主要试剂以及配制
• 3.2.3 主要仪器
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 PCR 引物设计与合成
• 3.3.2 提取各个组织中的总RNA
• 3.3.3 RNA 检测
• 3.3.4 反转录反应
• 3.3.5 半定量PCR 反应
• 3.3.6 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.3.7 荧光定量PCR 反应
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 各组织总RNA 的提取
• 3.4.2 用持家基因β-actin 引物进行RT-PCR 检测各组织cDNA 的质量
• 3.4.3 利用半定量PCR 构建鸡Lpin2 基因的组织表达谱
• 3.4.4 荧光定量RT-PCR 扩增曲线
• 3.4.5 荧光定量标准品扩增曲线与标准曲线
• 3.4.6 鸡Lpin2 基因在不同组织的表达差异
• 3.4.7 鸡Lpin2 基因在不同生长发育阶段的表达差异
• 3.5 讨论与结论
• 3.5.1 TaqMan 荧光探针技术的工作原理
• 3.5.2 TaqMan 荧光探针法引物和探针的设计
• 3.5.3 鸡Lpin2 基因在不同品种不同组织间的表达差异
• 3.5.4 鸡Lpin2 基因在生长发育不同时期的表达差异
• 4 鸡Lpin2基因多态性检测及与固始鸡资源群体相关性状的关联分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验动物
• 4.2.2 试验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 变异位点的检测
• 4.3.2 变异位点酶切结果
• 4.3.3 三个SNPs 的基因型和等位基因频率在品种间的分布
• 4.3.4 三个SNPs 的基因型和等位基因频率在固始鸡资源群的分布
• 4.3.5 三个SNPs 与固始鸡资源群相关性状的关联分析
• 4.4 讨论与结论
• 4.4.1 鸡Lpin2 基因三个SNPs 在品种间和固始鸡资源群的分布
• 4.4.2 鸡Lpin2 基因多态性对表型性状的影响
• 4.4.3 鸡Lpin2 基因多态性对血清生化指标的影响
• 5 总结
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录
• 附录1 鸡Lpin2 基因全编码序列
• 附录2 常用词语缩写
• 附录3 作者简介