地衣芽胞杆菌Lichenysin的生理功能及高产菌株构建

论文摘要

芽胞杆菌合成的表面活性素是种表面活性很强的脂肽类物质,在微生物原油开采、生物修复、医药抗病毒等领域都具有很大的应用潜能。表面活性素Lichenysin发酵产量低、生产成本高,限制了它的应用推广和研究发展。另外脂肽类物质在其生产菌的生命周期中起到的作用也没有引起足够的重视。本研究的主要目的是构建Lichenysin高产菌株,并研究其在菌体生长中的调控作用。本研究对地衣芽孢杆菌5.licheniformis WX-02全基因组测序的结果分析显示,该菌株具备Lichenysin合成的完整基因:编码合成酶体系的基因操纵.子lchA,及激活合成酶的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶PPTases的编码基因sfp。B.licheniformis WX-02发酵液具有排油圈活性,收集上清提取纯化脂肽类物质。提取物进行HPLC-MS分析,结果显示,B.licheniformis WX-02主要合成脂肪酸侧链别为C13、C14和C15的四种Lichenysin G同系物。Lichenysin的合成基因lchA启动子受ComA-P调控,其表达能力较弱。本研究通过基因工程技术,将lchA启动子PlchA替换为强启动子P43,构建成菌株WX-02 P43lchA。以Cooper基础培养基发酵,HPLC检测Lichenysin的相对含量,野生型WX-02 产量为 1249.6 ± 51.6 mAU×s,WX-02 P43lchA 产量为 2130.9 ± 23.3 mAU×s,工程菌WX-02P43lchA的Lichenysin,相比野生型产量提高了 70.53%。此外,敲除lchA的启动子PlchA,得到工程菌WX-02 △PlchA,该菌株同时阻断Lichenysin和ComS的合成;敲除lchA第三个开放阅读框lchAC得到工程菌WX-02 △lchAC,只阻断Lichenysin合成。检测以上两株工程菌的发酵液,都没有检测到Lichenysin,震荡产生的泡沫稀少,菌体生长没受到干扰,达到了构建低泡沫工程菌株的效果。测定野生型与三株工程菌的群游和生物膜合成能力,发现WX-02P43lchA比野生型有极大提高,而两株缺失株的能力则相对减弱或丧失。Lichenysin能促进微生物的群游与生物膜的形成,而这两方面能力又与生物定殖及生物防治息息相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 芽胞杆菌生成的脂肽类结构与性质
• 1.1.1 表面活性素（surfactin）家族
• 1.1.2 伊枯草菌素（iturin）家族
• 1.1.3 丰杆菌素（fengycin）家族
• 1.2 表面活性素的合成相关基因及合成机制
• 1.2.1 表面活性素的合成酶体系
• 1.2.2 表面活性素的合成基因
• 1.3 表面活性素的生理功能
• 1.3.1 在拮抗中的功能
• 1.3.2 在细菌运动（motility）中的作用
• 1.3.3 在生物膜（biofilm）形成中的作用
• 1.3.4 在种间、种内起到的信号作用
• 1.4 表面活性素家族的研究现状
• 1.4.1 生物表面活性剂的研究现状
• 1.4.2 表面活性素的研究现状
• 1.5 群体感应系统与Surfactin合成的调控
• 1.5.1 芽胞杆菌的群体感应系统
• 1.5.2 Surfactin的合成调控机制
• 1.6 本课题的研究目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基、培养温度和抗生素使用浓度
• 2.1.3 工具酶及试剂
• 2.1.4 PCR引物
• 2.1.5 抽提液和缓冲液
• 2.1.6 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 分子生物学方法
• 2.2.1.1 大肠杆菌质粒DNA的制备
• 2.2.1.2 芽胞杆菌基因组DNA小量抽提
• 2.2.1.3 地衣芽胞杆菌质粒DNA提取
• 2.2.1.4 DNA体外重组操作
• 2.2.1.5 PCR扩增
• 2.2.2 大肠杆菌重组质粒转化
• 2.2.2.1 大肠杆菌氯化钙法感受态制备及转化
• 2.2.2.2 大肠杆菌转化的菌落PCR验证
• 2.2.3 地衣芽胞杆菌温敏型敲除质粒的构建
• 2.2.4 地衣芽胞杆菌重组质粒转化
• 2.2.4.1 地衣芽胞杆菌电转化感受态制备和电转化
• 2.2.4.2 地衣芽胞杆菌转化子的验证
• 2.2.5 地衣芽胞杆菌基因敲除方法
• 2.2.6 发酵条件
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 生物量和葡萄糖检测
• 2.3.2 LC-MS鉴定表面活性物质
• 2.3.3 Lichenysin产量的检测
• 2.3.4 群游与生物膜实验
• 2.3.5 数据处理
• 3 结果和分析
• 3.1 表面活性物质Lichenysin的鉴定
• 3.1.1 地衣芽胞杆菌Lichenysin合成基因的确定
• 3.1.2 表面活性物质Lichenysin的LC-MS鉴定
• 3.2 Lichenysin整合型超表达株与缺失株构建
• 3.2.1 Lichenysin整合型超表达菌株WX-02 P43lchA构建
• 3.2.1.1 整合型超表达载体T2PlchA:P43构建
• 3.2.1.2 Lichenysin整合型超表达株构建
• 3.2.2 Lichenysin及ComS合成同时缺失株构建
• 3.2.2.1 PlchA敲除载体T2△PlchA构建
• 3.2.2.2 Lichenysin及ComS合成缺失株WX-02 △PlchA构建
• 3.2.3 Lichenysin合成缺失株构建
• 3.2.3.1 lchAC敲除载体T2△lchAC的构建
• 3.2.3.2 Lichenysin缺失株WX-02 △lchAC构建
• 3.3 野生型与工程菌Lichenysin产量的差异
• 3.4 野生型与工程菌群游及生物膜形成能力的差异
• 3.4.1 野生型与工程菌群游能力差异
• 3.4.2 野生型与工程菌生物膜形成能力的差异
• 4 讨论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录