金褐霉素基因工程菌的构建及表达产物的纯化

论文摘要

金褐链霉菌（Streptomyces aureofuscus）是从我国土壤中分离得到的链霉菌新种,其产生一种四烯大环内酯类抗真菌抗生素——金褐霉素（Aureofuscin）,金褐霉素化学结构与国外文献报道的纳他霉素（Natamycin）结构相似。金褐霉素对霉菌、多种酵母菌及丝状真菌有很强的抗菌作用,但不抗细菌。临床上用于治疗真菌性角膜炎,其疗效优于两性霉素B,同时对一些真菌引起的皮肤病及霉菌性阴道炎等也有很好疗效。金褐霉素早在1975年发现时只作了早期化学结构和初步药效试验后,一直未作深入研究和进行产业化开发。鉴于金褐霉素与纳他霉素有着相似的化学结构和生物活性,而纳他霉素现在主要依赖进口。因此,我国具有自主知识产权的金褐霉素的研究开发在真菌疾病的防治和食品防腐上显示出了极好的应用前景和市场潜力,这对促进新药研制、食品防腐和发酵工业的发展都具有积极意义。金褐霉素是一种天然的生物防腐剂,目前市场的需求量很大,但限制其生产的主要原因就是发酵产量太低。本文对金褐霉素生物合成基因簇中调控基因进行了初步研究,实验主要通过过度表达线性反应中某一基因来提高最终产物产量,以期获得较为高产的金褐霉素生产菌株,以及发酵条件优化来提高金褐霉素产生菌的发酵产金褐霉素水平。1)确立了高效液相色谱法（HPLC）测定发酵液中的金褐霉素的条件。检测波长:303nm;流动相:甲醇:水体积比为60∶40,流速:1.00mL/min,保留时间为6.957min。线性回归方程为Y=8E+07X-381894,R2=0.9998。当信噪比为3时的最小检测限为0.25μg/mL。样品的平均回收率（n=3）为100.09%、100.90%、102.41%,RSD为0.18%、1.53%、1.29%。2)本试验发现金褐链霉菌DNA中存在纳他霉素生物合成基因簇中基因pimM的一个同源基因,并将这段基因命名为AURJ3M。两者的基因序列具有95%的相似性,这两种蛋白的氨基酸序列同源性为97%。将获得的新基因序列登录GenBank,登录号为EU697915。3)本试验将纳他霉素生物合成基因簇的正调控基因pimM置于PermE之下进行整合性表达,克隆到高效表达质粒载体pSET152中,成功构建大肠杆菌ET12567与金褐链霉菌SYAU0709属间接合转移重组质粒PBJPIM,将PBJPIM转入金褐链霉菌野生型菌株SYAU0709染色体DNA上,其转化子的金褐霉素产量提高3-4倍,说明pimM基因在金褐链霉菌中能够促进金褐霉素的合成。4)本试验将pimM的一个同源基因AURJ3M置于PermE之下进行整合性表达,克隆到高效表达质粒载体pSET152中,成功构建大肠杆菌ET12567与金褐链霉菌SYAU0709属间接合转移重组质粒PBJJ3M,将PBJJ3M转入金褐链霉菌野生型菌株SYAU0709染色体DNA上,其转化子的金褐霉素产量提高5-6倍,说明AURJ3M基因在金褐链霉菌中促进了金褐霉素的合成,并且遗传性能稳定。5)以金褐霉素摇瓶发酵为基础,进行由摇瓶到5L发酵罐的放大,确定培养条件为:通气量4L/min,搅拌转速220r/min,发酵的溶氧界点不低于20%、发酵周期84h和产素期pH应控制在5.5,最佳的接种量10%,金褐霉素产量为3.85mg/mL。6)X-5大孔吸附树脂对金褐霉素的吸附率和解吸率都较高,可以作为纯化金褐霉素的树脂。纯化条件为吸附8h,解吸5h,上样液pH值5.0,洗脱液pH值7.0,吸附流速为1.0BV/h,洗脱流速为1mL/min。此方法得到了金褐霉素的粗结晶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 金褐霉素简介
• 1.2 金褐霉素的结构和理化性质
• 1.3 金褐霉素的研究概况
• 1.4 链霉菌的基因组研究进展
• 1.5 链霉菌次生代谢研究进展
• 1.6 本课题的立题依据与目的意义
• 1.7 本研究的总工艺流程
• 第二章 金褐霉素检测方法的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试验药品
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 检测波长的选择
• 2.2.2 流动相中甲醇与冰醋酸水溶液的比例对保留时间的影响
• 2.2.3 流动相中冰醋酸含量对保留时间的影响
• 2.2.4 冰醋酸含量对金褐霉素峰形的影响
• 2.2.5 金褐霉素标准品与发酵样品的色谱峰
• 2.2.6 金褐霉素的标准曲线
• 2.2.7 精密度和回收率试验
• 2.2.8 实际样品分析
• 2.3 结论
• 2.4 讨论
• 第三章 PimM基因在金褐链霉菌中的表达及对金褐霉素合成的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 缓冲液及试剂
• 3.1.4 抗生素及其使用浓度
• 3.1.5 酶及化学试剂
• 3.1.6 仪器设备
• 3.1.7 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 PimM基因的PCR扩增
• 3.2.2 质粒PBJERM的构建
• 3.2.3 质粒PBJPIM的构建
• 3.2.4 重组质粒PBJPIM的转化
• 3.2.5 转化子的发酵研究
• 3.3 结论
• 3.4 讨论
• 第四章 PimM的一个同源基因PimM-AURJ3M在金褐链霉菌中的表达及对金褐霉素合成的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 PimM基因多序列比对
• 4.2.2 AURJ3M基因的PCR扩增及克隆至T-载体
• 4.2.3 SYAU0709的AURJ3M与JCM4693的PimM的同源性比较
• 4.2.4 质粒PBJJ3M的构建
• 4.2.5 重组质粒PBJJ3M的转化
• 4.2.6 转化子的发酵研究
• 4.2.7 基因AURJ3M的表达对金褐链霉菌菌体生长与金褐霉素合成的影响
• 4.3 结论
• 4.4 讨论
• 第五章 金褐霉素高产菌株5L发酵罐放大培养及纯化研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 试验药品
• 5.1.4 主要仪器
• 5.1.5 试验方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 摇瓶剪切力模拟试验
• 5.2.2 搅拌速度对分批发酵的影响
• 5.2.3 最适接种量的确定
• 5.2.4 大孔吸附树脂对金褐霉素的吸附解吸性能比较
• 5.2.5 X-5树脂对金褐霉素的静态吸附与解吸曲线
• 5.2.6 pH值对X-5树脂吸附和解析的影响
• 5.2.7 甲醇的浓度对X-5树脂解析的影响
• 5.2.8 上柱流速对树脂吸附的影响
• 5.2.9 洗脱流速对树脂解吸效果的影响
• 5.2.10 动态解吸曲线
• 5.2.11 样品结晶
• 5.2.12 样品的结构鉴定
• 5.3 结论
• 5.4 讨论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 本研究的创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士期间发表学术论文
• 论文图表统计