脊髓骨髓间充质干细胞促进损伤脊髓修复和神经干细胞的分化

论文摘要

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSC)及其同时应用免疫抑制药物他克莫司(FK506)对脊髓损伤后神经功能恢复、对星形胶质细胞增生、对空洞形成以及损伤区神经细胞凋亡的影响,探讨BMSC促进脊髓功能恢复的机制;探讨BMSC对神经干细胞分化的影响。方法实验一:提取BMSC;制作大鼠脊髓损伤模型;将体外培养的骨髓间充质干细胞注入脊髓损伤区域,同时联合腹腔注射FK506,于伤后1w、2w、4w、6w、8w采用BBB评分及斜板实验观察神经恢复情况,并行TUNEL染色观察各组神经细胞凋亡的情况。8周后取材行GFAP免疫组化观察,并测量各组脊髓空洞的大小。实验二:提取神经干细胞;制作大鼠脊髓损伤模型;将体外培养的骨髓间充质干细胞注入脊髓损伤区域,在三天及五周后采集脑脊液;将收集的脑脊液分别与神经干细胞球和神经干细胞与雪旺细胞混合液共同培养,于培养72小时后在倒置显微镜下观察细胞形态、黏附力及代谢状况并随机测量各实验组神经细胞10个轴突长度,用免疫组化进行神经元染色观察神经干细胞的分化情况。结果实验一:1、单纯BMSC移植组与BMSC联合FK506治疗组两组大鼠后肢运动功能均有较明显的恢复,2周开始出现后肢活动,逐步恢复排尿,伤后4周变化最为明显,伤后8周可见协调运动,BMSC联合FK506治疗组恢复情况最快,BBB最高评分可达14分,统计学上有显著差异(P＜0.05);2、单纯BMSC移植组与BMSC联合FK506治疗组与对照组相比在不同时间段内神经细胞凋亡数都减少,联合治疗组凋亡细胞数减少最为明显(P＜0.05),TUNEL阳性细胞数3天达到高峰,7天后开始减少;3、应用BMSCs治疗后大鼠脊髓中反应性星型胶质细胞数量及GAFP染色面积均减小,而BMSCs联合FK506更加明显减轻反应性神经胶质增生程度以及减小GFAP染色面积(P＜0.05);4、损伤8周后两治疗组形成的脊髓空洞明显减小,BMSC联合FK506治疗组减小的更为明显(P＜0.05)。实验二:1、在脑脊液培养神经干细胞球实验中,BMSC移植3天后采集脑脊液组的神经干细胞球贴于培养板底部,并有细胞突生长。BMSC移植5周后采集脑脊液组显示仅有少量的神经干细胞球贴于培养板底部,细胞突短小少见。2、在脑脊液与神经干细胞和雪旺细胞共同培养的实验中发现BMSC移植组的神经干细胞球贴壁,细胞分化明显,细胞突细长,明显多于其它组;雪旺细胞和神经干细胞相互具有亲和现象,细胞突起沿雪旺细胞呈放射状伸展,形成类似“海星”状排列。结论1、移植的大鼠骨髓间质干细胞在脊髓损伤部位能长期存活,并能向邻近脊髓内迁徙。骨髓间质干细胞移植对于后肢功能的恢复有促进作用,减少星形胶质细胞的增生,缩小空洞形成体积,抑制神经细胞凋亡。联合应用FK506有协同效果。脊髓损伤后的恢复的微环境需要多个因素的共同作用,FK506是其中的一个有利因素。2、BMSC分泌的各种因子能够促进神经干细胞的分化,并能也能协同雪旺细胞促进神经干细胞的分化。

论文目录

• 内容提要
• 第1章 前言
• 第2章 综述
• 2.1 脊髓损伤研究现状
• 2.2 脊髓急性损伤修复的研究现状及策略
• 2.3 骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤现状
• 第3章 大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养
• 3.1 试验材料
• 3.2 大鼠骨髓间质干细胞（rBMSC）的分离培养
• 第4章 完全性脊髓损伤动物模型的制作
• 4.1 钳夹法制作完全性脊髓损伤动物模型
• 4.2 讨论
• 4.3 大鼠脊髓损伤后相关护理
• 第5章 BMSC移植和联合应用FK560对神经功能恢复的影响
• 5.1 材料及方法
• 5.2 结果
• 5.4 小结
• 第6章 BMS移植和联合应用FK560对神经细胞凋亡的影响
• 6.1 试验材料与方法
• 6.2 结果
• 6.3 小结
• 第7章 BMSC移植和联合应用FK560对神经胶质增生的影响
• 7.1 材料与方法
• 7.2 结果
• 7.3 小结
• 第8章 BMSC移植和联合应用FK560对残留空洞大小的影响
• 8.1 材料及方法
• 8.2 结果
• 8.3 结论
• 第9章 BMSC移植后脑脊液对神经干细胞球分化的影响
• 9.1 材料和方法
• 9.2 移植MSCs后的脑脊液（MSCc-CSF）培养神经干细胞
• 9.3 试验结果
• 9.4 小结
• 第10章 BMS移植后脑脊液联合雪旺细胞促进神经干细胞分化
• 10.1 材料和方法
• 10.2 试验结果
• 10.3 结论
• 第11章 讨论
• 第12章 结论
• 参考文献
• 附图
• 攻读博士期间发表的论文
• 致谢
• 论文摘要
• ABSTRACT