论文摘要
背景随着人类生活方式及饮食习惯的改变,代谢综合征（Metabolic syndrome,MS）已成为严重威胁人类健康的疾病。MS是一种介于正常代谢与2型糖尿病之间的状态,包括腹型肥胖、糖耐量异常、血脂异常、高血压以及胰岛素抵抗等一组心血管疾病危险因素的症候群。近半个世纪来,国内外学者对MS进行了大量研究,虽然取得了阶段性研究成果,但MS的发生机制仍未被完全阐明。MS的发病机制十分复杂,既与遗传易感基因有关,又涉及某些环境因素。目前大部分观点认为,MS的发生是复杂的遗传与环境因素相互作用的结果,而胰岛素抵抗是MS的病理生理基础与核心。但胰岛素抵抗又是如何发生的?它的始动因素是什么?至今尚无定论。最近有资料表明,胰岛素抵抗是一种慢性低水平的炎症状态,炎症在MS的发生过程中发挥了重要作用。而在炎症—胰岛素抵抗—MS这一病理生理过程中,脂肪组织的内分泌调节功能障碍扮演了重要角色。白介素-18（IL-18）是一种促炎症因子,在炎症反应链中起重要作用。临床研究发现,肥胖人群的IL-18水平升高,且随着体重的降低,IL-18、白介素6（IL-6）及C-反应蛋白（CRP）水平下降,脂联素水平上升;IL-18是2型糖尿病及非糖尿病患者胰岛素抵抗的标志。以上证据充分说明IL-18水平与MS危险性相关。最新的研究显示,人腹部及皮下脂肪细胞表达IL-18基因,肿瘤坏死因子α（TNF-α）能增强IL-18基因表达;脂肪细胞可以分泌IL-18,肥胖者较非肥胖者脂肪细胞分泌IL-18的能力强3倍;肥胖人群脂肪组织IL-18 mRNA水平升高且与胰岛素抵抗呈正相关。但以往有关IL-18与MS关系的研究仅限于临床,目前尚无系统的动物实验研究报道。MS已成为严重威胁人类健康的疾病,寻找能有效治疗和预防MS的药物显得尤为重要。炎症参与MS的发生,抑制慢性、亚临床性炎症已成为改善胰岛素抵抗、治疗MS的新靶点。目前已经被证实具有一定抗炎作用的药物包括原有的降糖药、调脂药、ACEI和ARB、大剂量阿斯匹林等,均可不同程度地改善胰岛素抵抗。相对上述药物,CCB类降压药在胰岛素抵抗和MS患者中的作用尚未受到应有的重视。多项大规模临床试验结果证实,CCB类降压药能有效降低伴糖尿病的高血压患者心血管事件死亡率,具有降压以外的心血管保护作用;CCB还能改善肥胖的2型糖尿病患者胰岛素抵抗,降低血TNF-α水平。但CCB能否通过抗炎作用抑制和延缓MS各代谢异常目前尚无定论。因此我们推测,IL-18可在脂肪组织表达,并通过脂肪组织在MS发病中发挥重要作用;非络地平可改善MS各代谢异常并下调IL-18在脂肪组织的表达,可能为CCB类降压药防治MS提供新的理论依据。目的1.探讨IL-18在果糖诱导的MS大鼠模型脂肪组织中的表达;2.探讨脂肪组织IL-18的表达和MS的关系;3.探讨非络地平对MS各代谢异常及IL-18在脂肪组织表达的影响。方法5周龄Wistar大鼠33只,随机分为两组:对照组（n=12只）,果糖组（n=21只）。对照组以标准大鼠饲料喂养及普通饮水,果糖组大鼠以标准大鼠饲料喂养,并给予10%（w/v）高果糖饮水。果糖喂养32周后,将果糖组大鼠再随机分为两组:果糖组（n=9只）,继续给予高果糖饮水并每天以生理盐水灌胃:非络地平组（n=9只）,继续给予高果糖饮水的同时,每天以非络地平（5mg/kg.d）灌胃。继续喂养及药物干预共持续6周,处死动物,留取脂肪标本备用。实验过程中,进行以下检测:（1）各组大鼠每隔2周测量体重及尾动脉血压一次。（2）分别于喂养前、喂养32周及干预后6周抽血测定空腹血脂、血糖、胰岛素以及血清IL-18,并计算稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。（3）脂肪组织病理学检测。（4）免疫组织化学染色法进行脂肪组织IL-18定位。（5）实时定量RT-PCR法检测IL-18 mRNA的表达。（6）Western-blot法检测IL-18蛋白含量的表达。结果1.实验动物基本情况:实验过程中共有3只大鼠死亡,均为果糖喂养组大鼠,在果糖喂养10～32周内死亡,而在干预期6周内无大鼠死亡。共30只大鼠完成实验,其中对照组12只,果糖组9只,非络地平组9只。2.果糖喂养32周两组大鼠代谢指标比较果糖喂养前,两组大鼠体重、尾动脉收缩压、血脂、血糖、空腹胰岛素及HOMA-IR均无差异（P＞0.05）。高果糖喂养32周后,与对照组比较果糖组大鼠体重、尾动脉收缩压、血甘油三酯、血胰岛素及HOMA-IR升高,差异有显著性意义（P＜0.01～0.0001）;而两组大鼠血糖及血总胆固醇无显著差异。表明经32周果糖喂养,已成功建立了大鼠MS模型。3.非络地平干预后对大鼠各代谢指标的影响非络地平药物干预前,与对照组比较果糖喂养各组大鼠体重、尾动脉血压、甘油三酯、血胰岛素及HOMA-IR均明显升高,表明已经成功建立MS模型。非络地平干预后6周,与果糖组比较,非络地平组尾动脉血压（P＜0.0001）、血胰岛素（P＜0.0001）及HOMA-IR（P＜0.05）显著降低;而体重、甘油三酯在非络地平组与果糖组间无显著差异。与干预前比较,非络地平组在干预后尾动脉血压（P＜0.01）、血胰岛素（P＜0.05）及HOMA-IR（P＜0.05）降低,差异有显著性意义;而体重和甘油三酯在非络地平干预前后则无显著差异。4.非络地平干预前后各组大鼠血清IL-18水平比较非络地平干预前,果糖喂养各组大鼠血清IL-18水平较对照组明显升高;干预后果糖组与非络地平组大鼠血清IL-18水平仍明显高于对照组（P＜0.0001）。与干预前比较,非络地平组在干预后血清IL-18水平显著降低（P＜0.01）;果糖组干预前后无明显变化。5.脂肪组织病理观察HE染色显示:对照组脂肪细胞体积较小,大小均一,饱满,排列较整齐;果糖组脂肪细胞体积变大,大小不均一,形态不规则,排列紊乱;细胞壁不完全清楚,细胞相交处可见融合,有合成大细胞的趋势。非络地平组脂肪细胞介于对照组与果糖组之间。6.脂肪组织IL-18免疫组织化学染色检测染色阳性信号为棕色,定位于细胞间质及细胞胞浆内。对照组细胞间质呈现浅棕色,胞浆内偶可见浅棕色颗粒;果糖组细胞间质呈现深棕色,胞浆内可见较浓密的深棕色颗粒;非络地平组细胞间质则介于两组之间,胞浆内偶见浅棕色的颗粒。7.实时定量RT-PCR检测脂肪组织中IL-18 mRNA表达与对照组相比,果糖组大鼠脂肪组织IL-18 mRNA表达明显升高（0.072±0.016vs0.019±0.006.P＜0.01）;与果糖组相比,非络地平组大鼠脂肪组织IL-18 mRNA表达水平显著下降（0.016±0.007 vs 0.072±0.016,P＜0.01）。相关性分析显示,果糖组IL-18 mRNA表达与HOMA-IR呈明显的正相关（r=0.74,P＜0.01）。8.Western-blot检测脂肪组织IL-18蛋白表达与对照组相比,果糖组大鼠脂肪组织IL-18蛋白表达水平显著升高（1.010±0.149vs0.531±0.085.P＜0.01）;与果糖组相比,非络地平组脂肪组织IL-18蛋白表达则显著下降（0.579±0.124vs1.010±0.149,P＜0.01）。相关性分析显示,果糖组IL-18蛋白表达与HOMA-IR呈明显的正相关（r=0.82,P＜0.01）。结论1.应用高果糖饮水并适当延长喂养时间,成功地建立了符合人类特征的大鼠MS模型,为MS发病机制的研究奠定了基础。2.从蛋白、基因水平均证实IL-18在脂肪组织中表达。3.果糖喂养大鼠血清和脂肪组织中IL-18表达升高,且与HOMA-IR呈明显正相关,提示脂源性炎症因子IL-18参与了大鼠MS的病变过程。4.非络地平可降低MS大鼠血压,改善胰岛素抵抗,降低血清和脂肪组织IL-18表达,提示非络地平可通过抗炎作用改善胰岛素抵抗,从而防治MS的发生。背景代谢综合征（MS）的发病机制十分复杂,既与遗传易感基因有关,又涉及某些环境因素,为多种因素综合作用的结果。目前大部分观点认为,MS的发生是复杂的遗传与环境因素相互作用的结果,而胰岛素抵抗（IR）是MS的病理生理基础与核心。随着分子生物学的发展,人们逐渐认识到胰岛素信号转导障碍可引起IR。发生IR的分子机制是靶细胞胰岛素受体（InsR）后信号传导通路的缺陷,其中IRS-1、PI-3K及PKB/Akt信号传递分子受损最为关键。越来越多的实验资料证实炎症和IR/MS之间存在相关和因果关系。研究发现,InsR后的信号通路与炎症因子的信号传导存在交叉作用,非特异性炎症所产生的炎症因子干扰胰岛素IRS/PI-3K信号转导通路,是炎症导致IR的主要分子机制。目前许多证据还表明脂肪组织是IR产生的始发部位,尤其是内脏脂肪组织在IR/MS的发生和发展过程中起着非常重要的作用。脂肪组织既是能量储存中心,又具有强大的内分泌功能。肥胖时,特别是腹部肥胖,脂肪组织表达的脂肪因子谱发生改变,细胞因子能够阻止InsR信号在脂肪和其他胰岛素敏感组织的转导,从而直接参与了IR的形成。本研究的第一部分结果显示,IL-18在脂肪组织的表达升高与IR相关,提示IL-18可能通过脂肪组织参与了IR/MS的病理生理过程。最新研究表明,IL-18能通过NF-κB依赖性途径参与炎症反应,增加多种细胞因子及炎症因子的表达。而InsR后的信号通路与炎症因子的信号传导存在交叉作用。因此,我们提出IL-18可能通过抑制脂肪组织IRS-1/PI-3K/Akt胰岛素信号通路促进IR,从而导致MS的发生。另一方面,由于Akt在胰岛素刺激的葡萄糖摄取中起重要作用,是目前胰岛素信号通路中最为人知的下游成分。TRB3是晚近在果蝇体内发现一种抑制有丝分裂的蛋白激酶,资料显示TRB3可通过直接与Akt结合,阻断该激酶的活化以中断胰岛素信号,在肝脏诱导IR。以上提示TRB3可能通过抑制Akt活化导致IRfMS的发生,此外,TRB3的基因水平可能被细胞内各种应激如炎症刺激上调。因此我们推断IL-18可诱导TRB3在脂肪组织的上调,进而抑制Akt活化,导致了IR/MS的发生。综上所述,我们提出如下假说:IL-18通过抑制脂肪组织IRS-1/PI-3K胰岛素信号转导,诱导脂肪组织TRB3表达上调,共同导致Akt活化抑制,促进IR/MS的发生。深入研究此信号通路的作用及其调控机制,可能为防治MS提供新的思路。目的1.明确脂肪组织IRS-1/PI-3K/Akt及TRB3/Akt信号转导障碍在MS大鼠IR发病中的作用:2.构建IL-18腺病毒载体并转染MS大鼠,探讨IL-18对果糖诱导的MS大鼠各代谢异常的影响;3.探讨脂肪组织IL-18在IR发病中的作用及其信号转导机制。方法5周龄Wistar大鼠48只,随机分为两组:对照组（n=12只）,果糖组（n=36只）。对照组以标准大鼠饲料喂养,果糖组大鼠以标准大鼠饲料喂养,并给予10%（w/v）高果糖饮水。果糖喂养32周后,将果糖组大鼠再随机分为三组:果糖组（n=9只）,继续给予果糖饮水;空载体组（n=9只）,继续给予果糖饮水的同时,通过尾静脉注射1×1010pfu含GFP的腺病毒载体;IL-18载体组（n=12只）,继续给予果糖饮水的同时通过尾静脉注射1×1010pfu含IL-18的腺病毒载体;对照组及果糖组同时经尾静脉注射等体积的生理盐水作对照。腺病毒载体转染后继续喂养6周。实验过程中,进行以下检测:（1）各组大鼠每隔2周测量体重及尾动脉血压一次。（2）分别于喂养前、喂养32周及转染后6周抽血测定空腹血脂、血糖、胰岛素,并计算稳态模型胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。（3）载体转染0,1,2,3,4,6周抽血测定血清IL-18浓度。（4）实时定量RT-PCR法检测IL-18及TRB3mRNA的表达。（5）Western-blot法检测IL-18及IL-18后的信号通路各关键分子蛋白含量的表达。结果1.实验动物基本情况:实验过程中共有6只大鼠死亡,均为果糖喂养组大鼠,在果糖喂养10～32周内死亡,而在腺病毒载体转染后6周内无大鼠死亡。共42只大鼠完成实验,其中对照组12只,其中对照组12只,果糖组9只,空载体组9只,IL-18载体组12只。2.IL-18腺病毒载体转染前两组大鼠体重、血压及生化指标比较果糖喂养前,两组大鼠体重、尾动脉收缩压、血脂、血糖、空腹胰岛素等指标均无差异（P＞0.05）。高果糖喂养32周后,与对照组比较果糖组大鼠体重、尾动脉收缩压、血甘油三酯、血胰岛素及HOMA-IR升高,差异有显著性意（P＜0.01～0.0001）;而两组大鼠血糖及血总胆固醇无显著差异。表明经32周果糖喂养,已成功建立了大鼠MS模型。3.IL-18腺病毒载体转染后各组大鼠血清IL-18水平变化IL-18腺病毒载体转染0～6周,对照组、果糖组及空载体组血清IL-18水平均无明显改变,IL-18载体组则随时间呈现比较显著的变化趋势;转染后各个时间点,果糖喂养各组大鼠血清IL-18水平均较对照组明显升高（P＜0.001）。IL-18腺病毒转染0周,IL-18载体组大鼠与空载体组比较,血清IL-18水平未见明显升高;转染后1周,载体组较之空载体组血清IL-18水平显著升高（P＜0.0001）:载体组于转染后2周血清IL-18水平达到最高,约为空载体组的4倍（P＜0.0001）;载体组血清IL-18水平于转染后3周开始降低,但仍明显高于空载体组（P＜0.0001）;4周、6周时载体组血清IL-18水平已与空载体组水平相当,差异无统计学意义。4.IL-18腺病毒载体转染后对大鼠各代谢指标的影响IL-18腺病毒载体转染前,与对照组比较果糖喂养各组大鼠体重、尾动脉血压、甘油三酯、血胰岛素及HOMA-IR均明显升高,表明MS模型已经成功建立。IL-18腺病毒载体转染6周后,与对照组比较果糖喂养各组大鼠体重、尾动脉血压、甘油三酯、血胰岛素及HOMA-IR均明显升高;与果糖及空载体组比较,载体组血胰岛素水平（P＜0.001）及HOMA-IR（P＜0.05）显著升高,而体重、血压、甘油三酯在载体组与空载体组间无显著差异。与转染前比较,IL-18载体组血胰岛素水平（P＜0.001）及HOMA-IR（P＜0.05）显著性升高,而体重、血压、甘油三酯在载体组与空载体组间无显著性差异。5.实时定量RT-PCR检测脂肪组织IL-18和TRB3 mRNA表达水平与对照组比较,果糖喂养各组大鼠脂肪组织IL-18 mRNA表达均明显上调（果糖组:P＜0.01;空载体组:P＜0.01;载体组:P＜0.001）;与果糖组、空载体组比较,IL-18载体组大鼠脂肪组织IL-18 mRNA表达明显增加（P＜0.01）;而果糖组与空载体组大鼠脂肪组织IL-18 mRNA表达无显著性差异。与对照组比较,果糖喂养各组大鼠脂肪组织TRB3 mRNA表达均明显上调（果糖组:P＜0.01;空载体组:P＜0.01;载体组:P＜0.001）;与果糖组、空载体组比较,IL-18载体组大鼠脂肪组织TRB3 mRNA表达明显增加（P＜0.01）:而果糖组与空载体组大鼠脂肪组织TRB3 mRNA表达无显著性差异。6.Western-blot检测脂肪组织IL-18及IL-18后的信号通路中各关键分子蛋白表达水平（1）各组大鼠脂肪组织IL-18蛋白表达水平比较:与对照组比较,果糖喂养大鼠脂肪组织IL-18蛋白表达显著升高（P＜0.01）;与果糖组、空载体组比较,载体组IL-18蛋白表达明显升高（P＜0.01）;而果糖组与空载体组IL-18蛋白表达则未见显著性差异。（2）各组大鼠脂肪组织IRS-1蛋白表达水平比较:与对照组比较,果糖喂养大鼠脂肪组织IRS-1蛋白表达明显降低（果糖组:P＜0.05;空载体组:P＜0.01;载体组:P＜0.01）;与果糖组、空载体组比较,IL-18载体组IRS-1蛋白表达显著降低（P＜0.01）;而果糖组与空载体组IRS-1蛋白表达则未见显著性差异。（3）各组大鼠脂肪组织p85/P-p85蛋白表达水平比较:四组大鼠脂肪组织p85总蛋白表达水平比较,均未见显著性差异。与对照组比较,果糖喂养大鼠脂肪组织P-p85蛋白表达显著降低（P＜0.01）;与果糖组、空载体组比较,IL-18载体组P-p85蛋白表达显著降低（P＜0.01）:而果糖组与空载体组P-p85蛋白表达则未见显著性差异。（4）各组大鼠脂肪组织Akt/P-Akt蛋白表达水平比较:四组大鼠脂肪组织Akt总蛋白表达水平比较,均未见显著性差异。与对照组比较,果糖喂养大鼠脂肪组织P-Akt（Ser473）蛋白表达明显降低（P＜0.01）;与果糖组、空载体组比较,IL-18载体组P-Akt（Ser473）蛋白表达显著降低（P＜0.01）;而果糖组与空载体组P-Akt（Ser473）蛋白表达则未见显著性差异。（5）各组大鼠脂肪组织TRB3蛋白表达水平比较:与对照组比较,果糖喂养大鼠脂肪组织TRB3蛋白表达明显上调（P＜0.01）;与果糖组、空载体组比较,IL-18载体组TRB3蛋白表达上调更加显著（P＜0.01）;而果糖组与空载体组TRB3蛋白表达则未见显著性差异。结论1.果糖诱导的MS大鼠脂肪组织IRS-1/PI-3K信号抑制,TRB3表达上调,共同导致Akt活化抑制,提示脂肪组织IRS-1/PI-3K/Akt,TRB3/Akt信号转导障碍可导致IR;2.构建IL-18腺病毒载体并转染MS大鼠,血液中和脂肪组织中IL-18水平显著增加,同时血胰岛素及HOMA-IR进一步增加,提示IL-18可促进果糖诱导的MS大鼠IR的进展;3.IL-18载体组脂肪组织胰岛素信号转导进一步抑制,TRB3进一步上调,Akt活化抑制更加明显。提示IL-18通过抑制脂肪组织IRS-1/PI-3K胰岛素信号通路和诱导TRB3表达上调,共同导致Akt活化抑制,促进IR,从而导致MS的发生。