水稻CDPKs基因的表达谱分析和黑藻Hvppc2转基因水稻的培育和功能分析

论文摘要

植物钙依赖的蛋白激酶（CDPKs）是细胞体内Ca2+的受体蛋白,在植物生长发育、逆境胁迫反应、病原防御、离子通道运输等信号传导过程中起着重要的作用。本文通过对水稻基因组数据库搜索,共获得31个水稻CDPK基因。通过进化树分析和intron分析,探讨了水稻CDPK基因的进化。利用本室的水稻基因表达谱芯片数据库（CREP:http://crep.ncpgr.cn）,对31个OsCPK基因进行表达谱分析,根据芯片分析结果,对部分特异表达的基因进行Real-time PCR验证。主要研究结果如下:1.通过对CDPKs保守序列的搜索分析,在水稻基因组中鉴定出31个CDPKs基因,它们具有典型的CDPKs结构域,如Ser/Thr蛋白激酶区、自抑制区、调节区。对OsCPKs进行结构分析,除OsCPK30外,其它的OsCPKs都含有4个EF-手。N-末端可变区序列分析结果表明,21个OsCPKs含有豆蔻酰化位点,28个CDPKs预测含有棕榈酰化位点。2.大部分OsCPK基因含有5-7个内含子,而OsCPK4、OsCPK18和OsCPK30含有10-11个内含子,它们同时位于进化分析中的第四亚组;此外,衣藻仅有的2个CDPKs基因也属于第四亚组,说明第四亚组的CDPKs成员可能是最古老的成员。3.使用Affymetrix芯片检测水稻OsCPK基因在明恢63、珍汕97和汕优63三个水稻品种27个不同表达时期和组织中以及GA3、KT、NAA三种激素处理的表达谱,所有31个OsCPK基因都能在芯片上找到对应的探针,它们都在至少一个检测组织中有表达。4.OsCPK2、OsCPK11、OsCPK14等8个基因在花粉中特异表达,它们可能在花粉发育中起重要作用。OsCPK7、OsCPK12、OsCPK23等基因在胚乳中高表达,它们可能和种子发育有关。5.在3种激素处理中,一些OsCPK基因也受它们上调表达,如OsCPK5在这3种激素处理后,表达量都有所上升。人口不断增长以及可利用耕地的减少,使粮食安全受到前所未有的威胁。因此,改善作物的光合性能,突破产量限制是农业研究的重要研究方向。通过克隆C4植物中C4途径基因,导入水稻,创造C4水稻,已经成为研究热点。单细胞C4植物的存在,是将C3植物改造成C4植物的理论基础。本研究首次将克隆到的单细胞C4植物黑藻的Hvppc2基因的cDNA导入水稻中,并在rbcS启动子驱动下,成功地在水稻中表达,并对转基因植株进行了一系列的光合测定和生理测定。1.获得的转Hvppc2基因水稻的PEPC酶活是野生型植株酶活的1-4倍,而NADP-ME和PPDK酶活没有改变。2.PEPC酶活高的转Hvppc2基因植株在高光强下有更高的净光合速率,但转基因植株的暗呼吸和原种没有差异。3.在PEG-6000模拟干旱胁迫下,转Hvppc2基因植株的脯氨酸含量提高,但可溶性糖含量,MDA含量和SOD活性没有明显改变,说明转Hvppc2基因水稻存在潜在的抗旱能力。4.在大田种植条件下,除株高相对变矮外,转基因植株的其它农艺性状没有明显改变,和原种相比,单株产量没有差异。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 水稻CDPKs在全生育期和激素处理的表达谱分析
• 1 文献综述
• 1.1 植物钙依赖的蛋白激酶
• 1.1.1 植物中的CDPK/SnRK蛋白激酶家族
• 1.1.2 CDPKs活性的调节
• 2+调节'>1.1.2.1 Ca²⁺调节
• 1.1.2.2 磷酸化调节
• 1.1.2.3 磷脂调节
• 1.1.2.4 14-3-3蛋白调节
• 1.1.3 CDPKs的亚细胞定位
• 1.1.4 CDPKs基因表达分析
• 1.1.5 CDPKs在钙信号转导的作用
• 1.1.5.1 CDPKs在植物生长发育过程中的作用
• 1.1.5.2 CDPKs在非生物胁迫信号传导中的作用
• 1.1.5.3 CDPKs在植物防御反应中的作用
• 1.1.5.4 CDPKs在离子运输中的调节作用
• 1.1.5.5 CDPKs在激素应答中的作用
• 1.1.5.6 CDPKs在细胞骨架组构重排中的作用
• 1.1.6 CDPKs信号途径的特异性和交叉性
• 1.1.7 植物CDPKs的全基因组分析及表达谱研究
• 1.2 基因芯片技术在水稻基因表达上的应用
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 数据库搜索
• 3.2 基因和蛋白结构分析
• 3.3 进化树分析
• 3.4 芯片表达谱分析
• 3.5 RNA提取和Real-time PCR
• 4 结果与分析
• 4.1 水稻CDPKs基因的基本信息
• 4.2 进化树分析
• 4.3 OsCPKs外显子-内含子和模体分析
• 4.4 OsCPKs基因芯片表达谱分析
• 4.5 OsCPKs基因在激素（GA3、NAA和KT）处理后的表达分析
• 5 讨论
• 5.1 水稻CDPKs基因分析
• 5.2 水稻OsCPKs的进化
• 5.3 OsCPKs在种子发育中的作用
• 5.4 OsCPKs在花粉发育中的作用
• 5.5 OsCPKs与激素调节
• 4型PEPC基因的克隆及转基因水稻培育和研究'>第二章 黑藻C₄型PEPC基因的克隆及转基因水稻培育和研究
• 1 文献综述
• 3植物、C₄植物和CAM植物的光合原理'>1.1 C₃植物、C₄植物和CAM植物的光合原理
• 4光合作用的进化'>1.2 C₄光合作用的进化
• 4光合作用的概况'>1.2.1 C₄光合作用的概况
• 4光合途径进化的原因及基础'>1.2.2 C₄光合途径进化的原因及基础
• 4光合作用的进化过程'>1.2.3 C₄光合作用的进化过程
• 4光合作用的分子进化'>1.2.4 C₄光合作用的分子进化
• 1.2.4.1 CA（Carbonic anhydrase）
• 1.2.4.2 PEPC
• 1.2.4.3 NADP-ME
• 1.2.4.4 PPDK
• 1.2.4.5 Rubisco
• 4基因对C₃植物的转化及其生理影响'>1.3 C₄基因对C₃植物的转化及其生理影响
• 1.3.1 PEPC
• 3植物的转化及表达'>1.3.1.1 PEPC对C₃植物的转化及表达
• 1.3.1.2 超表达PEPC植物的生理特性
• 1.3.2 NADP-ME的转基因应用
• 1.3.3 PPDK的转基因应用
• 1.3.4 双基因转化和多转基因
• 1.4 高光效基因转化存在的问题
• 2 本研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 目的基因
• 3.3 实验所用到的菌株和载体
• 3.4 Hvppc2基因的克隆
• 3.5 超表达载体构建
• 3.6 水稻愈伤诱导和遗传转化
• 3.7 转基因植株PCR检测
• 3.8 转基因植株拷贝数分析及表达量检测
• 3.9 转基因水稻叶片PEPC、NADP-ME、PPDK酶活性的测定
• 3.10 光合生理测定
• 3.10.1 气体交换测定
• 3.10.2 叶绿素荧光测定
• 3.10.3 叶绿素含量测定
• 3.11 模拟干旱条件下转基因植株的生理测定
• 3.11.1 SOD活性的测定
• 3.11.2 MDA含量的测定
• 3.11.3 脯氨酸含量的测定
• 3.11.4 可溶性糖含量的测定
• 3.12 主要农艺性状的考察
• 4.结果与分析
• 4.1 Hvppc2基因的克隆分析
• 4.1.1 Hvppc2蛋白质功能位点和结构域分析
• 4.1.2 Hvppc2蛋白氨基酸序列的进化分析
• 4.2 Hvppc2超表达植株的获得及分子检测
• 4.3 pR1300-hvppc2转基因植株的酶活测定
• 4.4 pR1300-hvppc2转基因植株的气体交换参数测定
• 4.5 叶绿素荧光特性的初步测定
• 4.6 叶绿素含量比较
• 4.7 模拟干旱条件下转基因植株的生理测定
• 4.7.1 转Hvppc2基因水稻的SOD含量分析
• 4.7.2 转Hvppc2基因水稻的MDA含量分析
• 4.7.3 转Hvppc2基因水稻的脯氨酸含量和可溶性糖含量分析
• 4.8 转Hvppe2基因水稻农艺性状考察
• 5 讨论
• 5.1 高表达Hvppc2基因水稻有更好的光合能力
• 5.2 高表达Hvppc2基因水稻有潜在的耐旱能力
• 5.3 转Hvppc2基因水稻农艺性状考察
• 5.4 后续工作探讨
• 5.5 小结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 Protocols
• 附录2