NGAL蛋白的重组表达与纯化及其对食管癌细胞的体外诱导作用研究

论文摘要

NGAL（Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin）,一种25kD的糖蛋白,是lipocalin家族的新成员,具有典型的β折叠桶形空间结构特点。近年来有研究报道,NGAL蛋白可能拥有,1)保护调节基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9;即Gelatinase B）的活性;2)参与炎症与天然免疫反应;3)作为一种新型的铁离子转运载体,介导着一条新的独特的跨膜转铁通路等功能。2000年以来,我们课题组相继研究发现, NGAL在人食管上皮细胞癌变中异常过表达; NGAL异常过表达可促进食管癌细胞的侵袭移动; NGAL促进食管癌细胞侵袭移动主要由MMP-9等介导;下调NGAL表达可使食管癌细胞的微丝骨架和形态结构发生显著改变,促进癌细胞分化,与癌细胞的前体细胞/永生化食管上皮细胞的形态特征趋于一致。这些实验结果表明,NGAL可能是人类的一种十分重要的癌蛋白,与食管癌等肿瘤密切相关。然而在食管癌细胞中NGAL蛋白究竟是如何发挥作用的,尚有许多不明之处,具体包括如下三个方面:1哪种膜受体介导NGAL蛋白跨膜;2哪条通路参与NGAL蛋白的细胞内信号转导传递;3最终又有哪些基因应答NGAL蛋白的作用,发生表达变化;等等。为此,在本文中,我们着重探讨了NGAL蛋白在体外对食管癌细胞的诱导作用,发现体外直接加入的NGAL蛋白与细胞内表达的NGAL蛋白,对食管癌细胞所产生的生物学效应明显不一样,前者诱导食管癌细胞发生一种特殊形式的自噬,但不是凋亡,而后者会进一步增进食管癌细胞的侵袭转移能力,同时促进实验动物发生恶病质。有关体外直接加入NGAL蛋白诱导食管癌细胞发生自噬的实验结果详见下述。首先,在酵母细胞中重组表达NGAL蛋白,柱层析分离纯化,得到NGAL蛋白纯品溶液。其次,筛选NGALR（NGAL Receptor）高表达与弱表达的人食管癌细胞系,EC1.71和EC109,作为对比实验细胞模型。再次,将不同浓度的NGAL蛋白分别加入到EC1.71和EC109食管癌细胞培养上清中作用不同时间。最后,通过综合运用荧光显微镜观察、相差显微镜观察、免疫印迹、RT-PCR和ferrozine染色等多种实验技术手段,结合生物信息学分析,研究了NGAL蛋白对食管癌细胞的体外诱导作用。具体实验结果包括如下八个方面:1)EC1.71和EC109皆可以内吞NGAL蛋白到细胞内,但相比较而言,EC1.71内吞NGAL蛋白的能力明显强。2)随着加入NGAL蛋白的浓度逐渐增高,特别是达到50μg/ml时,两种食管癌细胞EC1.71和EC109的形态均发生明显改变,主要特征是细胞收缩变小,形态变圆,同时细胞数目也减少,细胞的贴壁能力下降;而两种食管癌细胞EC1.71和EC109相比,应对NGAL蛋白的诱导作用,EC1.71似乎更敏感一些,形态变化更显著,细胞收缩更明显。3)单丹磺酰戊二胺（Monodansylcadaverine,MDC）标记,绿色荧光检测结果表明,与对照组相比,随着NGAL蛋白浓度逐渐由低到高,特别是当浓度升高达到5-50μg/ml时,两种食管癌细胞EC1.71和EC109的绿色荧光显色均显著变强,表明有明显的细胞自噬发生。但两种食管癌细胞EC1.71和EC109相比,在NGAL蛋白浓度相同条件下,似乎前者的绿色荧光显色更强一些。这可能同样与两种细胞的NGALR表达,以及其它相关分子的差异性本质有关。4)在pLC3-GFP融合质粒预先转染的基础上,检测LC3的异位分布变化情况,结果发现,在50μg/ml的NGAL蛋白作用后,无论是EC1.71,还是EC109,两种食管癌细胞均发生了明显的LC3易位分布变化,显现典型的膜性易位聚集特征,表明细胞确实发生了自噬。5)有关NGAL蛋白对食管癌细胞内铁离子与铁蛋白水平影响的检测结果表明,在本文的细胞模型实验条件下,外源性NGAL蛋白的作用并未引起细胞内的铁离子浓度明显改变,而细胞内铁蛋白的表达水平也未受到明显影响。6)有关NGAL蛋白激活食管癌细胞ERK细胞信号转导通路的检测结果表明,50μg/ml的NGAL蛋白仅分别作用5min,两种食管癌细胞均出现了p-ERK1/2水平的明显升高,而且在接续下来的30min-24h时间范围内一直保持着这种水平,而在此之前,至少NGAL蛋白作用6h,模型细胞尚未发生明显的自噬现象。这表明ERK1/2激活是细胞自噬前的生物化学反应事件,可能是NGAL蛋白诱导食管癌细胞发生自噬的分子机制关键环节所在。7)有关NGAL蛋白激活食管癌细胞p38和JNK细胞信号转导通路的检测结果表明,在NGAL蛋白作用下,细胞中p38和JNK等MAPK的活性有一定的变化,但不如ERK明显。8)有关自噬相关基因atg5、beclin1和DAPK等的转录情况的检测结果表明,NGAL蛋白的作用能够使EC1.71和EC109,在前期激活ERK1/2之后,进一步导致atg5、beclin1和DAPK等自噬相关基因转录增强。综合以上实验结果可见,诱导细胞发生自噬是外源性NGAL蛋白经由内吞途径进入食管癌细胞发挥作用的机制之一,与NGAL蛋白跨膜转铁未见直接关联,而ERK信号转导途径可能参与了这一过程。

论文目录

摘要

英文摘要

英文缩略词表

第1章绪论

1. 细胞凋亡

2. 自噬

3. NGAL

4. NGAL、细胞凋亡与自噬的关系

第2章 NGAL 蛋白的酵母表达与纯化

第1节重组NGAL 酵母表达载体的构建

第2节酵母表达的NGAL 蛋白的纯化

2.1 前言

2.2 NGAL 蛋白纯化方案

2.3 材料与方法

2.3.1 NGAL 蛋白重组表达酵母的培养与诱导

2.3.2 硫酸铵盐析

2.3.3 Bio-gel P-30 凝胶过滤层析

2.3.4 SP-Sepharose fast flow 阳离子交换层析

2.3.5 High Q Support 阴离子交换层析

2.3.6 除盐与保存

2.3.7 SDS-PAGE

2.3.8 Western blotting

2.3.9 等电聚焦电泳

2.3.10 Bradford 法蛋白含量的测定

2.4 结果与讨论

2.4.1 硫酸铵盐析重组表达 NGAL 蛋白的酵母上清液中的蛋白组分

2.4.2 凝胶过滤层析

2.4.3 阳离子交换层析

2.4.4 阴离子交换层析

2.4.5 不同纯化方案的比较

2.4.6 NGAL 蛋白的稳定性与纯化

2.4.7 除盐与保存

2.4.8 NGAL 蛋白纯度的检测

2.4.9 结论

2.5 仪器与试剂

2.5.1 仪器

2.5.2 试剂

2.5.3 试剂配制

第3章 NGAL 蛋白对食管癌细胞的体外诱导作用

3.1 引言

3.2 实验研究方案

3.3 材料与方法

3.3.1 细胞与细胞培养

3.3.2 免疫荧光染色检测 NGALR 定位表达

3.3.3 NGAL 蛋白的荧光标记及其细胞内吞实验

3.3.4 细胞形态学观察

3.3.5 细胞自噬体的特异性标记与观察

3.3.6 细胞自噬特异性蛋白LC3 的表达分布检测

3.3.7 检测细胞内铁离子浓度

3.3.8 免疫印记检测相关蛋白表达水平

3.3.9 RT-PCR 检测细胞自噬相关基因转录水平

3.4 结果

3.4.1 食管癌细胞表达NGALR 及其NGAL 蛋白内吞

3.4.2 NGAL 蛋白诱导食管癌细胞形态改变

3.4.3 NGAL 蛋白诱导食管癌细胞发生自噬

3.4.4 NGAL 蛋白对食管癌细胞内铁离子与铁蛋白水平的影响

3.4.5 NGAL 蛋白激活食管癌细胞的ERK1

3.5 讨论

3.6 仪器与试剂

3.6.1 主要仪器

3.6.2 主要试剂

本文结论

参考文献

致谢

NGAL蛋白的重组表达与纯化及其对食管癌细胞的体外诱导作用研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢