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rlz-8诱导SGC7901细胞自噬性死亡机制的研究

2020-12-11阅读(809)

rlz-8诱导SGC7901细胞自噬性死亡机制的研究

论文摘要

本文探讨了重组灵芝免疫调节蛋白（recombinant Ganoderma Lucidum immunoregulatory protein, rlz-8）诱导SGC7901胃癌细胞发生内质网应激进而介导自噬性细胞死亡的机制。在体外实验中,rlz-8可明显抑制SGC7901细胞增殖,使细胞阻滞于细胞周期的G0/G1期。将FITC与rlz-8偶联后利用激光共聚焦进行亚细胞定位检测结果显示：内质网可能是rlz-8发挥作用的靶位点之一。我们采用高通量基因芯片筛选技术对rlz-8诱导SGC7901细胞基因变化进行了检测,同时结合生物信息学分析了rlz-8诱导SGC7901细胞自噬性死亡过程中差异基因的变化,初步确定了rlz-8诱导内质网应激和自噬性细胞死亡的主要信号通路。利用免疫印迹和实时定量PCR技术检测了内质网应激相关标志分子GRP78、ATF4、CHOP的变化,实验结果显示,rlz-8触发SGC7901细胞自噬性死亡与内质网应激有关。利用电子显微镜观察结果表明,rlz-8能诱导细胞出现大量具有膜结构的自噬体和自噬溶酶体,ATF4、LC3B等细胞自噬相关分子的变化也证明rlz-8具有诱导细胞自噬的作用。利用RNA干扰技术抑制ATF4、CHOP的表达,可降低内质网应激强度和细胞自噬强度,rlz-8对SGC7901细胞的杀伤作用也随之降低。流式细胞仪对细胞凋亡率检测,没有发现caspases蛋白的调节活性,细胞线粒体膜电位无明显变化,caspases基因调节通路抑制剂不影响SGC7901细胞的死亡进程,这些结果显然证明,rlz-8杀伤SGC7901细胞的机制不是经典的细胞凋亡综上所述,rlz-8是通过诱导SGC7901细胞发生自噬性死亡而完成了对细胞的杀伤作用,且这种死亡方式由内质网应激所介导,其中ATF4——CHOP通路为关键信号传导通路。实验的创新之处在于：（1）研究课题揭示了一种外源蛋白定位在SGC-7901胃癌细胞的内质网中,由于过度积累引起内质网应激,进而触发自噬依赖性的肿瘤细胞死亡相关的分子机制,由于目前还未见与本研究相关的报道,研究成果将填补国际同类领域的空白。（2）基因芯片技术已经较为成熟,但是将这种高通量技术与下游的分析计算技术和算法结合来分析内质网应激与细胞自噬之间的关系及细胞自噬如何被调节走向死亡的分子机制的研究在国内外还未见报道。

论文目录

  • 内容提要
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 英文缩写词表
  • 引言
  • 第1章 绪论
  • 1.1 简述真菌免疫调节蛋白家族
  • 1.1.1 国内外对真菌免疫调节蛋白研究的进展
  • 1.1.2 主要四种真菌免疫调节蛋白国内外研究现状
  • 1.2 胃癌及其治疗现状
  • 1.3 程序性细胞死亡的研究进展
  • 1.3.1 细胞凋亡
  • 1.3.2 细胞坏死
  • 1.3.3 细胞自噬性死亡
  • 1.4 内质网应激的研究进展
  • 1.5 内质网应激导致细胞死亡的研究进展
  • 1.6 rlz-8的前期研究
  • 第2章 材料和方法
  • 2.1 实验仪器
  • 2.2 实验试剂
  • 2.3 菌株和细胞株
  • 2.4 试剂配制
  • 2.4.1 药物配制
  • 2.4.2 酵母菌培养相关溶液的配制
  • 2.4.3 细胞培养相关溶液的配制
  • 2.4.4 免疫印迹实验相关缓冲溶液的配制
  • 2.5 实验方法
  • 2.5.1 rlz-8的表达及纯化
  • 2.5.2 细胞培养
  • 2.5.3 WST-1检测法
  • 2.5.4 rlz-8-FITC蛋白在SGC7901细胞内的定位
  • 2.5.5 AnnexinV/PI凋亡检测
  • 2.5.6 透射电镜
  • 2.5.7 Hoechst33342对细胞核形态学检测
  • 2.5.8 Caspase活性检测
  • 2.5.9 细胞线粒体膜电位检测
  • 2.5.10 实时定量PCR检测
  • 2.5.11 免疫印迹
  • 2.5.12 RNA干扰实验
  • 2.5.13 基因芯片
  • 2.6 统计学方法
  • 第3章 实验结果
  • 3.1 rlz-8的表达、纯化和活性
  • 3.1.1 rlz-8的表达及纯化
  • 3.1.2 rlz-8的活性
  • 3.2 rlz-8抑制SGC7901细胞增殖
  • 3.2.1 rlz-8对SGC7901细胞的细胞周期影响
  • 3.2.2 rlz-8对SGC7901细胞的杀伤作用
  • 3.3 rlz-8-FITC在SGC-7901细胞中的定位
  • 3.3.1 rlz-8-FITC在SGC-7901细胞中的动态变化
  • 3.3.2 rlz-8对SGC-7901细胞的形态影响
  • 3.3.3 rlz-8-FITC在SGC-7901细胞中的亚细胞定位
  • 3.4 基因芯片分析结果
  • 3.4.1 rlz-8对胃癌SGC-7901细胞差异基因芯片分析结果
  • 3.4.2 差异表达基因的验证
  • 3.5 rlz-8触发了内质网应激
  • 3.5.1 rlz-8对内质网应激相关标志分子的影响
  • 3.6 rlz-8诱导SGC7901细胞发生自噬
  • 3.6.1 超微结构观察
  • 3.6.2 rlz-8对细胞自噬相关分子的影响
  • 3.6.3 细胞内溶酶体变化
  • 3.7 内质网应激在rlz-8诱导细胞自噬中的作用
  • 3.7.1 抑制内质网应激对Atg5蛋白的影响
  • 3.7.2 抑制内质网应激过程中LC3B的变化
  • 3.8 自噬在rlz-8杀伤SGC7901细胞过程中的影响
  • 3.8.1 RNA干扰对细胞生长的影响
  • 3.8.2 内质网应激在rlz-8抑制细胞存活率的影响
  • 3.8.3 自噬在rlz-8抑制细胞存活率的影响
  • 3.9 rlz-8杀伤SGC7901细胞过程中未诱导细胞凋亡
  • 3.9.1 rlz-8诱导SGC7901细胞死亡过程中细胞核形态变化
  • 3.9.2 AnnexinV/PI检测细胞凋亡率
  • 3.9.3 Caspase-3活性分析
  • 3.9.4 线粒体膜电位变化
  • 第4章 讨论
  • 4.1 rlz-8抑制SGC7901细胞增殖并触发内质网应激
  • 4.2 rlz-8触发内质网应激过程中引发了细胞自噬
  • 4.3 自噬在rlz-8诱导SGC-7901细胞死亡中的作用
  • 4.4 rlz-8诱导的细胞死亡方式中不包含细胞凋亡
  • 第5章 结论
  • 参考文献
  • 作者简介及在学期间所取得的科研成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

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