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苦瓜抗HIV毒蛋白MAP30基因的克隆及原核表达

2020-11-24阅读(241)

苦瓜抗HIV毒蛋白MAP30基因的克隆及原核表达

论文摘要

Ⅰ型核糖体失活蛋白MAP30，是从苦瓜种子和果实中分离纯化的一种HIV病毒抑制剂，具有抗病毒、抗肿瘤和抗菌作用。本文根据已发表的MAP30基因的序列比对结果，采用PCR法从精选白皮苦瓜（JX）、穗农早优苦瓜（ZY）、碧翠苦瓜（BC）、银田长白苦瓜（YT）和银田蓝山大白苦瓜（LAN）5个品种中克隆得到5个长度均为861bp的MAP30基因，即JX-MAP30、ZY-MAP30、LAN-MAP30、BC-MAP30（Genebank accession No：DQ643967）和YT-MAP30（DQ643968），其中除BC-MAP30和YT-MAP30基因与已报道的MAP30基因（AJ294541）不同，存在变异位点外，其余均相同。因此，本研究重点对BC-MAP30和YT-MAP30的核苷酸以及推测的氨基酸序列进行了分析，并利用生物信息学方法对其蛋白质二级结构作了预测。此外，还对YT-MAP30基因的完整编码区（YTf）和成熟蛋白编码区（YTm）片段同时进行了原核表达工程菌的构建、表达条件的优化以及表达产物的SDS-PAGE检测、可溶性分析和蛋白质杂交分析等研究工作。其主要结果如下：1．序列分析表明，BC-MAP30和YT-MAP30的核苷酸序列与已报道的MAP30基因分别存在2个和3个碱基的不同，但均编码263个氨基酸残基组成的成熟蛋白。2．BC-MAP30和YT-MAP30基因的推导氨基酸序列与其他葫芦科植物的Ⅰ型核糖体失活蛋白以及天花粉毒蛋白、多花白树毒蛋白、肥皂草毒素蛋白的氨基酸序列同源性分别为68.90％、82.75％、71.25％和66.45％，且其第90～220位氨基酸序列较为保守。利用生物信息学进行的二级结构预测表明，在BC-MAP30和YT-MAP30蛋白的整个二级结构中，无规则卷曲含量最高，其次是α-螺旋和β-折叠。信号肽区富含α-螺旋和无规则卷曲；N-端区富含β-折叠和无规则卷曲：高度螺旋区富含α-螺旋；C-端则富含无规则卷曲。3．DNA测序结果表明，在重组表达质粒中，YTf-MAP30和YTm-MAP30的序列和插入位点正确。SDS-PAGE分析结果显示，pET-YTm／MAP30-BL21工程菌在30℃、1mmol／LIPTG诱导4h后，在35kD处出现一条增加的表达蛋白条带，且以可溶形式表达。4．蛋白质分子杂交表明，重组蛋白对鼠抗His-tag多克隆抗体具有特异抗性。5．pET-YTf／MAP30-BL21工程菌经不同诱导时间、诱导温度和不同浓度诱导物IPTG诱导，SDS-PAGE分析均无特异的表达蛋白条带出现，表明YTf-MAP30信号肽的存在影响其在E．coli BL21（DE3）PlysS系统中的原核表达。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 1 引言
  • 2 核糖体失活蛋白概述
  • 2.1 核糖体失活蛋白的分类
  • 2.2 核糖体失活蛋白的生理功能
  • 3 苦瓜抗HIV毒蛋白MAP30
  • 3.1 苦瓜的功效研究
  • 3.2 MAP30的结构和基本特征
  • 3.3 MAP30蛋白的功能与作用机制
  • 3.4 MAP30蛋白的药理作用
  • 3.5 MAP30的免疫原性及其他
  • 3.6 MAP30的基因克隆和重组研究进展
  • 3.7 MAP30在医学和农业上的应用
  • 4 本研究的目的意义
  • 第二章 不同苦瓜品种中MAP30基因的克隆及序列分析
  • 1 引言
  • 2 材料和方法
  • 2.1 材料
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 引物设计
  • 2.2.2 苦瓜种子的发芽
  • 2.2.3 基因组DNA的提取
  • 2.2.4 MAP30基因的扩增及检测
  • 2.2.5 PCR产物回收、纯化
  • 2.2.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
  • 2.2.7 PCR扩增产物与pMD18-T载体的连接与转化
  • 2.2.8 转化大肠杆菌感受态细胞
  • 2.2.9 阳性克隆筛选及鉴定
  • 2.2.10 序列分析
  • 3 结果与分析
  • 3.1 MAP30基因的扩增及阳性克隆的鉴定
  • 3.2 阳性克隆的PCR鉴定
  • 3.3 目的基因MAP30序列分析
  • 3.4 BC-MAP30和YT-MAP30蛋白的基本性质预测
  • 3.5 BC-MAP30和YT-MAP30蛋白质的二级结构预测
  • 3.6 BC-MAP30和YT-MAP30蛋白与其它RIPs氨基酸同源性的比较分析
  • 4 讨论
  • 5 结论
  • 第三章 YT-MAP30基因的克隆及原核表达
  • 1 引言
  • 2 材料和方法
  • 2.1 材料
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 YT-MAP30片段表达载体构建策略
  • 2.2.2 引物设计
  • f-MAP30和YTm-MAP30克隆载体的构建及鉴定'>2.2.3 YTf-MAP30和YTm-MAP30克隆载体的构建及鉴定
  • f-MAP30和YTm-MAP30表达载体的构建及鉴定'>2.2.4 YTf-MAP30和YTm-MAP30表达载体的构建及鉴定
  • f-MAP30和YTm-MAP30的诱导表达'>2.2.5 YTf-MAP30和YTm-MAP30的诱导表达
  • 2.2.6 重组蛋白SDS-PAGE分析
  • m/MAP30-BL21工程菌重组蛋白的可溶性分析'>2.2.7 pET-YTm/MAP30-BL21工程菌重组蛋白的可溶性分析
  • m-MAP30表达产物western blot分析'>2.2.8 YTm-MAP30表达产物western blot分析
  • 3 结果与分析
  • f-MAP30和YTm-MAP30片段的PCR扩增'>3.1 YTf-MAP30和YTm-MAP30片段的PCR扩增
  • f-MAP30和pMD-YTm-MAP30的鉴定'>3.2 重组克隆载体质粒pMD-YTf-MAP30和pMD-YTm-MAP30的鉴定
  • f-MAP30和pET-YTm-MAP30的鉴定'>3.3 重组表达质粒pET-YTf-MAP30和pET-YTm-MAP30的鉴定
  • f/MAP30-BL21和pET-YTm/MAP30-BL21的构建'>3.4 工程菌pET-YTf/MAP30-BL21和pET-YTm/MAP30-BL21的构建
  • 3.5 重组蛋白SDS-PAGE分析
  • f-MAP30表达产物的SDS-PAGE分析'>3.5.1 YTf-MAP30表达产物的SDS-PAGE分析
  • m-MAP30表达产物的SDS-PAGE分析'>3.5.2 YTm-MAP30表达产物的SDS-PAGE分析
  • m-MAP30表达产物western blot分析'>3.6 YTm-MAP30表达产物western blot分析
  • 4 讨论
  • 5 结论
  • 参考文献
  • 在读期间发表文章

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