甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因转化美丽胡枝子的研究

论文摘要

美丽胡枝子（Lespedeza formosa）是优良的水土保持和饲料型豆科灌木,提高美丽胡枝子的抗盐性,扩大其栽培区域是开发利用盐渍地的有效途径,具有重要的生产意义。本论文通过对美丽胡枝子子叶节再生条件、选择剂筛选条件和遗传转化条件等众多因素的优化,建立了美丽胡枝子高频再生系统和遗传转化体系,并将BADH基因导入到美丽胡枝子中,获得了耐盐性增强的转基因植株。主要研究内容及结果如下:1.利用L16（45）和L9（34）正交设计,研究了6-BA、2,4-D、NAA、IBA、蔗糖和苗龄等因素对美丽胡枝子子叶节再生、节段扩繁和试管苗生根的影响,建立了子叶节外植体高效再生体系。通过试验确定了美丽胡枝子子叶节再生的最佳培养基为MS+0.5mg.L-16-BA+1.0mg.L-12,4-D+0.5mg.L-1NAA;试管苗增殖的最佳培养基为:MS+ 1.0mg.L-16-BA + 0.05mg.L-1NAA ;最佳生根培养基为1/2MS+0.4mg.L-1IBA +0.2mg.L-1NAA+30g.L-1蔗糖;不同苗龄的子叶节再生能力差别不大。2.采用PCR的方法,分别从pMD18-T载体上和pBI121-bar中克隆目的基因BADH和带有标记基因bar的35S-bar-nos片断,将它们插入到pBI121中,构建了植物表达载体pBIBADHbar,并将其分别转化了根癌农杆菌LBA4404、EHA105和C58。3.通过浓度梯度试验,研究了头孢霉素（Cef）和羧苄青霉素（Carb）两种脱菌剂对三种农杆菌的抑菌效果,发现Carb的抑菌效果较差,Cef浓度在200～300mg.L-1之间能有效控制LBA4404和EHA105的生长,而对C58的抑制效果稍差。在此基础上进一步研究了美丽胡枝子对Cef和选择剂草丁膦（Glu）的敏感性,确定了Cef浓度≤300mg.L-1为可耐受浓度;Glu1.0mg.L-1为子叶节再生的临界浓度,Glu0.3mg.L-1为试管苗生长和增殖的临界浓度,Glu0.2mg.L-1为试管苗生根的临界浓度。4.通过L9（34）正交试验和时间、浓度梯度试验,对影响农杆菌转化效率的主要因素进行了研究。试验结果表明,LBA4404是侵染美丽胡枝子子叶节效果最佳的根癌农杆菌类型,菌液浓度以OD600=0.6～0.8较为合适;子叶节在农杆菌侵染前预培养1d,侵染时间为20～30min,感染后共培养3d可获得较好的转化效果,在共培养基中附加100umol.L-1的AS、延迟4d选择和选择压由低到高进行梯度选择均可使转化率明显提高,转化率最高可达28%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文缩略词
• 1 引言
• 1.1 研究的目的意义
• 1.2 植物盐害及其耐盐机理
• 1.3 植物耐盐基因工程研究进展
• 1.4 胡枝子的研究进展
• 1.5 研究的主要内容及技术路线
• 2 美丽胡枝子再生系统的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与分析
• 2.3 小结
• 3 植物表达载体PBIBADHBAR 的构建
• 3.1 实验材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 小结
• 4 美丽胡枝子遗传转化系统的建立
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与分析
• 4.3 小结
• 5 转基因植株的分子检测及功能验证
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果与分析
• 5.3 小结
• 6 讨论
• 7 结论与展望
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢
• 博硕士论文同意发表的声明