甘蓝型油菜基因组中开花期QTL的检测和分析

论文摘要

开花是高等植物由营养生长向生殖生长转变的标志之一,决定着植物的有性生殖。适时开花以避开不利外界环境,是植物得以繁衍的前提,也是决定作物能否获得丰收的优良农艺性状。植物的开花是由多基因所控制的各种生理生化代谢途径所决定的,是复杂的数量性状,同时也受各种外界环境因素的调节,其中温度和光照是关键的环境因子。油菜是重要的油料作物,根据开花是否需要低温春化,分为冬油菜和春油菜两种类型。人们对油菜开花的机制知之甚少,对决定油菜冬、春性分化的机制更不得而知。甘蓝型冬油菜品种Tapidor和半冬性油菜品种Ningyou7对低温春化需求不同。本实验室以这两个品种为亲本构建了TN DH群体并在9个冬油菜环境下种植了该群体。实验室还在TN DH群体基础上衍生了RC-F2群体。本论文报告了用TN DH群体做的两年春油菜开花试验,分析整理了DH群体和RC-F2群体多年多点共13个冬油菜实验的开花期数据;用100个MS-AFLP分子标记参与构建了含352个标记的初级的TN遗传连锁图,在此基础上整合了230个SSR标记,构建了含621个标记的高密度TN遗传连锁图;利用高密度图谱上229个有DNA序列信息的标记与拟南芥基因组进行了电子比对作图（in silico mapping）,在TN遗传图谱上定位了40个共线性区段和84个保守岛;然后采用QTL分析软件WinQTLcart2.5、QTLmapper2.0进行油菜开花期QTL及互作位点的检测和遗传效应分析,目的是在基因组水平上构建甘蓝型油菜开花性状的基因网络图。研究结果表明,在所有冬油菜环境中群体植株的开花期均表现超亲分离,证实TN DN群体的开花期为数量性状。为了充分揭示数量性状的多基因特征,本文不仅综合分析了两个群体13个冬、春油菜环境中在显著水平上（P=0.05）检测出的开花期QTL（称为显著水平QTL,significant level QTL,SL-QTL）,还将效应较小、显著性程度较低（0.5＜P＜0.05）但能重复检测到的QTL鉴别为微效真实QTL（micro-realQTL,MR-QTL）。结果共检测到42个开花期QTL,其中包括36个SL-QTL和6个MR-QTL。这42个QTL中,过半的QTL仅能在冬油菜种植环境检测到,其中第16连锁群上的一个QTL簇对冬油菜环境开花早晚有决定性作用。仅有1个QTL能在春油菜环境条件下检测到,为春油菜环境特异QTL。另外还检测到了63个互作对。通过电子比对,将拟南芥120个开花基因的548个同源基因定位到TN遗传图谱上,发现其中27%和9%的同源基因被分别定位到油菜开花期QTL置信区间和互作位点的标记区间,它们在很大程度上代表着油菜相应区间的开花功能基因。由此,一个由上百个QTL、互作位点和区间功能基因构成的甘蓝型油菜开花调控网络图初步形成。它不仅为进一步研究油菜开花性状提供了坚实的基础,同时为其它复杂农艺性状的解析拓宽了研究思路。为了进一步检验QTL定位的准确性和电子比对定位功能基因的可靠性,也为了为油菜的遗传改良提供重要的基因资源,本文对TN DH群体中表现春油菜环境特异性的主效应QTL作了较深入的解析。该QTL位于N10连锁群上,命名为qFT10-4。它在缺乏春化的环境条件下解释群体开花期变异（方差）的52%,而在越冬的冬油菜条件下对群体植株开花期表型变化无贡献。前人在拟南芥中已经揭示了开花的春化途径,而本试验开展的比较基因组学分析表明,春化途径中的关键抑制基因FLC在拟南芥基因组中所处的位置,正对应于qFT10-4的置信区间。以TN DH群体两亲本之一Tapidor中FLC的同源序列为探针与TN DH群体的总DNA进行Southern杂交,结果将FLC的一个RFLP多态性标记定位到TN遗传图谱上,正位于qFF10-4置信区间的峰值处,于是将该区间的同源FLC基因命名为BnFLC10。从双亲中分离出BnFLC10的长4.5kb的基因组序列,发现等位基因的第一个内含子中存在着三处碱基的差异。根据其中两个差异位点设计等位基因特异性的PCR引物M1和M2,对用半冬性油菜品种Ningyou7为轮回亲本、BnFLC10为目标基因构建的BC3F2群体,在春油菜环境下进行开花期表型和基因型的分析。卡方测验表明开花期表型分离符合3:1的分离比（晚花或不开花:早花）,同时基因型与表型共分离,表明BnFLC10为春油菜环境中控制TN DH群体开花早晚的主效基因。基因表达实验发现春化确实能使BnFLC10的表达下降,春化前BnFLC10的基因表达量在亲本Ningyou7中居于春油菜品种和冬油菜品种之间,冬油菜亲本Tapidor及其它冬油菜品种的表达量最高。对73个不同来源的油菜品种资源进行BnFLC10与油菜冬春性关联分析,结果M2扩增位点的多态性与开花早晚所表现的冬春性表型相关达到极显著水平（P=0.007）。这些研究均表明qFT10-4的候选基因BnFLC10为控制油菜品种冬、春性分化的关键基因。本论文提出了三个进一步研究课题:1.微效真实QTL的证实及QTL检测体系的改进;2.油菜冬、春性分化关键基因BnFLC10决定油菜种性的分子机理;3.冬油菜环境特异开花期QTL簇的解析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 植物数量性状的分子遗传分析
• 1.1.1 数量性状与数量性状位点（QTL）
• 1.1.2 QTL图谱定位原理
• 1.1.3 QTL的认定
• 1.1.4 上位性QTL分析
• 1.1.5 QTL区分和整合
• 1.1.6 QTL克隆
• 1.1.7 QTL的生物学意义
• 1.2 植物开花性状的研究
• 1.2.1 模式植物拟南芥开花途径研究
• 1.2.2 水稻、小麦等农作物开花性状的研究
• 1.2.3 芸薹属作物中开花性状研究
• 1.2.3.1 开花性状遗传模式研究
• 1.2.3.2 开花性状QTL定位研究
• 1.2.3.3 芸薹属植物中有关开花基因的研究
• 1.3 芸薹属植物和拟南芥比较作图研究
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2.甘蓝型油菜开花期及其相关性状QTL定位
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料和分析群体
• 2.2.2 春油菜环境田间试验
• 2.2.3 表型数据调查
• 2.2.4 冬油菜种植环境开花期数据的收集整理
• 2.2.5 甲基化敏感AFLP（MS-AFLP）标记的扩增
• 2.2.6 遗传连锁图谱的构建
• 2.2.7 开花期基本数据分析
• 2.2.8 QTL分析
• 2.2.9 遗传效应和遗传位点互作分析
• 2.2.10 抽薹期、现蕾期和开花期条件QTL分析
• 2.2.11 QTL区间和互作位点对应候选基因分析
• 2.2.11.1 TN遗传图谱与拟南芥比较作图
• 2.2.11.2 QTL区间或互作位点对应开花候选基因的确定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 亲本与两群体的开花期表型分析
• 2.3.2 开花期方差及遗传效应分析结果
• 2.3.3 TN遗传图谱和拟南芥基因组比较作图
• 2.3.5 全基因组互作位点检测结果
• 2.3.6 TN DH群体抽薹期和现蕾期的QTL分析
• 2.3.7 QTL和互作位点对应候选基因的分析
• 2.3.8 冬、春油菜环境特异主效QTL分析
• 2.3.8.1 春油菜环境特异QTL分析
• 2.3.8.2 冬油菜环境特异QTL分析
• 2.3.9 MS-AFLP标记在TN遗传图谱中的分布
• 2.4 讨论
• 2.4.1 多环境检测QTL的必要性
• 2.4.2 开花期QTL定位结果与前人研究结果的比较
• 2.4.3 甘蓝型油菜开花性状遗传控制体系
• 3.春油菜环境特异QTL的遗传分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 DNA的提取
• 3.2.3 SSR分析
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.5 目的片段的连接、转化和测序
• 3.2.6 从两亲本的基因组DNA中分离BnFLC10等位基因序列
• 3.2.6.1 表达序列的分离
• 3.2.6.2 5'端调控序列的分离
• 3.2.6.3 基因序列特征的比较分析和等位基因引物设计
• 3.2.7 BnFLC10在TN遗传图谱上的定位
• 3.2.7.1 RFLP标记
• 3.2.7.2 BnFLC10等位基因特异标记
• 3.2.7.3 带型赋值和作图
• 3.2.8 BnFLC10基因型和表型共分离分析
• 3F₂群体的构建'>3.2.8.1 BC₃F₂群体的构建
• 3F₂群体表型、基因型分析'>3.2.8.2 BC₃F₂群体表型、基因型分析
• 3.2.9 BnFLC10 mRNA表达实验
• 3.2.9.1 材料的春化处理
• 3.2.9.2 RNA的提取和RT-PCR扩增
• 3.2.10 BnFLC10等位基因与油菜冬、春性的关联分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 两亲本中BnFLC10等位基因序列比较
• 3.3.1.1 表达序列的比较
• 3.3.1.2 启动子端调控序列的比较
• 3.3.2 BnFLC10在TN遗传图谱上的定位
• 3.3.3 BnFLC10等位基因序列特异PCR引物的设计和基因定位
• 3F₂群体的构建、群体基因型和表型分析'>3.3.4 BC₃F₂群体的构建、群体基因型和表型分析
• 3.3.5 BnFLC10 mRNA表达实验结果
• 3.3.6 BnFLC10等位基因与油菜冬、春性的关联分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 候选基因法在油菜QTL克隆中的作用
• 3.4.2 BnFLC10在甘蓝型油菜冬、春性分化中的作用
• 3.4.3 本实验结果的潜在应用价值
• 4.研究结论与展望
• 4.1 研究结论
• 4.2 下一步工作展望
• 4.2.1 关于QTL的检测与分析
• 4.2.2 关于甘蓝型油菜冬、春性分化机理的研究
• 4.2.3 关于冬油菜环境特异QTL簇的解析
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表论文