榛花中抑制金黄色葡萄球菌化合物的筛选及抑菌机制研究

论文摘要

榛花（Corylus heterophylla Flowers）,为桦木科榛属植物榛和川榛及毛榛的雄花。榛花具有止血、消炎、降血糖和抗氧化等作用,被广泛应用于临床医学。如“复方榛花舒肝胶囊”、“解毒通络保肾胶囊”等。目前对于榛花上述活性的药理学机理尚不十分清楚。本文首次对榛花中的抑菌活性进行了系统研究,在活性引导下对具有抑菌活性的化合物进行分离和纯化,并对活性化合物的抑菌机制进行了初步研究。本研究为深入揭示榛花的药物学作用,以及揭示榛花发挥抗菌作用的药理学机制奠定了基础。本文采用95%乙醇回流提取法对榛花药材进行提取。利用萃取法对榛花提取物进行初步分离,分离得到石油醚相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、饱和正丁醇相和水相。应用牛津杯法对各萃取相进行抑菌实验,其中乙酸乙酯相抑菌圈直径最大,抑菌效果最好。乙酸乙酯相通过硅胶柱层析法进一步被分离得109个组分（ZF1-ZF109）,滤纸片法测定硅胶柱层析产物的抑菌活性,确定3个具有抑菌活性的组分（ZF15,ZF34,ZF75）。利用制备型高效液相色谱法对3个活性组分进行活性单体成分的分离。分析型高效液相色谱对活性单体物质进行纯度测定,3个单体化合物的纯度分别达到98.9%,98.2%,99.2%。联合应用液-质、核磁共振波谱法最终确定3个活性物质分别为hirsutanone,hirsutanonol,keampferol-3-O-α-L-（4’’-E-P-coumaroyl）-rhamnoside（KCR）。这三个化合物均首次从榛花中提取获得。通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色研究榛花中活性成分对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。结果表明hirsutanone,hirsutanonol,KCR对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别为0.008mg/ml,0.008mg/ml,0.02mg/ml。细胞膜完整性测定结果表明上述化合物均能破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的完整性。SDS-PAGE蛋白含量变化分析显示hirsutanone和hirsutanonol作用20h后,可溶性蛋白总量较对照组分别减少10.5%,6.43%;KCR作用20h后部分可溶性蛋白减少,25kD左右的谱带蛋白较对照组增加47.6%。通过对上述三种化合物广谱抑菌作用的研究表明hirsutanone,hirsutanonol对金黄色葡萄球菌、腊状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌、白色念珠菌、大肠杆菌、变形杆菌、藤黄微球菌均有不同程度的抑制作用。KCR对金黄色葡萄球菌、腊状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌表现出抑菌效果,但是对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、变形杆菌、藤黄微球菌表现出抑菌效果不明显。这说明3个单体化合物对于常见的细菌具有一定的广谱抗菌性。耐甲氧西林金葡菌是一种多重耐药菌,对大多数常用抗生素具有耐药作用,该菌是引起医院内感染的最常见病原菌之一。值得注意的是上述三个化合物对该菌也具有显著的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 榛花概述
• 1.1.1 榛属植物的分布及分类
• 1.1.2 榛花的化学成分研究
• 1.1.3 榛花的生物学作用
• 1.1.4 榛花药物的研究与开发
• 1.2 榛属植物的化学成分与生理活性研究
• 1.2.1 榛属植物化学成分的研究
• 1.2.2 榛属植物化学成分的生理活性研究
• 1.3 天然产物抑菌研究进展
• 1.3.1 具有抑菌作用的天然产物来源
• 1.3.2 植物中起抑菌作用的活性成分研究
• 1.4 植物有效成分的提取及分离纯化方法
• 1.4.1 植物有效成分的提取方法
• 1.4.2 植物有效成分的纯化方法
• 1.5 中药抑菌机制研究
• 1.5.1 对菌体细胞壁和细胞膜完整性的破坏
• 1.5.2 对菌体蛋白质含量的影响
• 1.5.3 对遗传物质DNA 或RNA 的合成影响
• 1.6 本研究的目的及意义
• 2 榛花提取物抑菌活性分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 中药及菌种
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 榛花粗提物的制备与分离
• 2.2.2 供试菌液的制备
• 2.2.3 萃取物抑菌活性确定
• 2.2.4 硅胶柱层析分离
• 2.2.5 组分抑菌活性筛选
• 2.2.6 活性组分的色谱分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 榛花乙醇回流提取物HPLC 分析
• 2.3.2 各萃取相HPLC 分析
• 2.3.3 萃取组分活性确定
• 2.3.4 活性部位的确定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 HPLC 液相方法的选择
• 2.4.2 硅胶柱层析体系的选择
• 2.4.3 活性位置的确定
• 2.5 小结
• 3 榛花抑菌活性物质的提取
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 中药
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 上样样品制备
• 3.2.2 制备型高效液相色谱分离
• 3.2.3 化合物纯度鉴定
• 3.2.4 化合物结构鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 榛花中所发现的三种化合物在自然界中的分布
• 3.4.2 制备型HPLC 液相方法的选择
• 3.5 小结
• 4 榛花提取物对金黄色葡萄球菌抑菌机制研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 中药及菌种
• 4.1.4 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 供试菌液的制备
• 4.2.2 最低抑菌浓度（MIC）测定
• 4.2.3 化合物对金黄色葡萄球菌生长抑制作用的测定
• 4.2.4 化合物对菌体培养液电导率的影响
• 4.2.5 化合物对菌体培养液中大分子物质的影响
• 4.2.6 化合物对菌体内可溶性蛋白含量的影响
• 4.2.7 化合物广谱抑菌试验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 化合物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度
• 4.3.2 化合物对金黄色葡萄球菌生长抑制作用的测定
• 4.3.3 化合物对金黄色葡萄球菌细胞膜的影响
• 4.3.4 化合物对细胞内可溶性蛋白含量的影响
• 4.3.5 化合物广谱抑菌试验
• 4.4 讨论
• 4.4.1 榛花中活性化合物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性
• 4.4.2 榛花中活性化合物对金黄色葡萄球菌的抑制机制
• 4.4.3 榛花中的有效成分具有广泛的抗菌活性
• 4.5 小结
• 结论
• 主要创新点
• 参考文献
• 附图: 图谱
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢