草菇cDNA削减文库的构建及三种多聚糖降解酶基因的克隆与表达

论文题目: 草菇cDNA削减文库的构建及三种多聚糖降解酶基因的克隆与表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 发酵工程

作者: 李迅

导师: 邵蔚蓝

关键词: 草菇,削减文库,差异杂交,木聚糖酶,葡萄糖苷酶,几丁质脱乙酰酶,克隆,表达,大肠杆菌,毕赤酵母,重组酶,纯化,酶学性质

文献来源: 江南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 食用菌能够利用废弃的木质纤维素类物质作为生长基质,通过生物转化将其转变为具有较高附加值的食品或药用子实体。草菇（Volvariella volvacea）主要生长在热带和亚热带地区,是世界第五大食用菌培育品种。它以稻草等秸秆为生长基质,生长温度比其它中温真菌高,这些特性显示其纤维降解酶系可能具有更好的温度稳定性。本文的研究内容是构建草菇cDNA削减文库,为建立高等担子菌基因高效表达体系提供有力的基因工程方面的支持;克隆一些有价值的多糖降解酶,并对它们的外源表达进行探讨。1.首先确定草菇中半纤维素酶和纤维素酶最佳mRNA丰度的诱导条件为:xylan和CMC各0.2%;（NH4）2SO40.2%;KH2PO4 0.2%;VB1 2.5 mg/L;MgSO4 0.1%;pH 7.5;150 rpm的转速培养。改进了担子菌草菇的总RNA抽提方法,用此方法获得的RNA满足了后继的cDNA合成需要。介绍一种改进的利用差异杂交和定向插入的方法构建全长cDNA削减文库,分别以诱导和非诱导条件培养草菇菌丝,两者都提取mRNA,由PowerScriptTM逆转录酶将诱导菌丝提取的mRNA逆转录成cDNA第一链,用得到的cDNA第一链和非诱导菌丝提取的过量mRNA进行杂交,将未杂交上的cDNA第一链洗脱浓缩后,用SMARTTM cDNA Library Construction试剂盒构建成草菇cDNA削减文库。经检测:原始文库滴度为2.5×105 pfu/ml,重组率为93%,插入cDNA大小在0.5～4.0 kb之间,文库扩增后,文库滴度为1.1×109pfu/ml。2.首次发现草菇中木聚糖酶基因的mRNA大规模异常剪辑现象,发生了内含子错读或外显子错误剪辑,形成不正常的mRNA。这可能是草菇适应环境一种调节方式,来满足

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 自然界存在的可再生资源-木质纤维、几丁质的研究现状

1.1.1 纤维素

1.1.2 半纤维素

1.1.3 几丁质和壳聚糖

1.1.4 木质纤维类和几丁质类物质水解方法

1.1.4.1 木质纤维类物质水解方法

1.1.4.2 几丁质类物质水解方法

1.2 纤维素降解酶系的研究现状

1.2.1 产纤维素酶系的细菌

1.2.2 产纤维素酶系的真菌

1.2.3 纤维素降解酶

1.3 半纤维素降解酶系的研究现状

1.3.1 产半纤维素酶系的细菌

1.3.2 产半纤维素酶系的真菌

1.3.3 纤维素降解酶

1.4 几丁质类物质降解酶系的研究进展

1.4.1 降解几丁质类物质的微生物

1.4.2 几丁质类物质的降解酶

1.5 丝状真菌cDNA 文库构建的研究现状

1.5.1 试剂盒的选择

1.5.2 丝状真菌削减文库的研究现状

1.6 立题背景及研究内容

参考文献

第二章 草菇cDNA 削减文库的构建

2.1 材料与方法

2.1.1 菌株及培养

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 正交实验的设计

2.1.4.1 正交实验一

2.1.4.2 正交实验二

2.1.5 草菇酶液的制备

2.1.6 木聚糖酶酶活测定方法

2.1.7 蛋白质浓度的测定

2.1.8 草菇总RNA 提取

2.1.8.1 菌株及培养

2.1.8.2 主要试剂

2.1.8.3 经典法

2.1.8.4 简易的方法

2.1.8.5 改进的方法

2.1.8.6 RNA 质量的检验

2.1.9 草菇poly(A)~+mRNA 分离与鉴定

2.1.9.1 材料

2.1.9.2 主要试剂

2.1.9.3 主要步骤

2.1.9.4 分离的poly(A)~+mRNA 的鉴定

2.1.10 诱导培养生成的草菇菌丝cDNA 第一链的合成

2.1.10.1 材料

2.1.10.2 主要试剂

2.1.10.3 具体方法

2.1.11 非诱导培养草菇菌丝所提mRNA 的变性及固定

2.1.11.1 材料

2.1.11.2 主要试剂

2.1.11.3 具体方法

2.1.12 非诱导mRNA 与诱导cDNA 第一链杂交

2.1.12.1 材料

2.1.12.2 主要试剂与设备

2.1.12.3 具体方法

2.1.13 削减cDNA 文库的构建

2.1.13.1 材料

2.1.13.2 主要试剂与设备

2.1.13.3 具体方法

2.2 结果

2.2.1 草菇中半纤维素酶和纤维素酶最佳mRNA 丰度的诱导条件

2.2.2 总 RNA 样品的分析

2.2.2.1 总RNA 样品的纯度分析

2.2.2.2 总 RNA 样品的完整性分析

2.2.3 poly(A)~+mRNA 的样品分析

2.2.4 cDNA LD-PCR 产物

2.2.5 削减cDNA 文库的构建

2.2.5.1 cDNA 的分级分离

2.2.5.2 cDNA 削减噬菌体文库的构建及文库滴度的确定

2.2.5.3 cDNA 削减噬菌体文库的扩增及扩增文库滴度的确定

2.2.5.4 cDNA 文库的鉴定

2.3 讨论

2.3.1 草菇中半纤维素酶和纤维素酶最佳mRNA 丰度的诱导条件

2.3.2 草菇总 RNA 的提取

2.3.3 差异杂交

2.3.4 削减文库的构建

2.4 本章小结

参考文献

第三章 草菇木聚糖酶基因的克隆及表达

3.1 材料和方法

3.1.1 菌株与质粒

3.1.2 主要试剂

3.1.3 PCR 引物

3.1.4 培养基和培养条件

3.1.5 主要仪器设备

3.1.6 电转化感受态细胞的制备

3.1.7 草菇基因组DNA的提取

3.1.8 琼脂糖电泳胶回收DNA片断和质粒抽提

3.1.9 原核重组质粒的构建

3.1.10 木聚糖酶基因的定点突变

3.1.11 木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

3.1.12 木聚糖酶活和蛋白质浓度的测定

3.1.13 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.2 结果

3.2.1 木聚糖酶基因的克隆

3.2.1.1 PCR 结果

3.2.1.2 草菇基因组木聚糖酶全序列的获得

3.2.1.3 Xyn3 序列的定点突变

3.2.2 木聚糖酶表达质粒的构建

3.2.3 重组质粒及转化子的鉴定分析

3.2.4 木聚糖酶在大肠杆菌中的表达

3.3 讨论

3.3.1 木聚糖酶的克隆

3.3.2 木聚糖酶的表达

3.4 小结

参考文献

第四章 β-葡萄糖苷酶的克隆、表达与定性

4.1 材料与方法

4.1.1 菌株与质粒

4.1.2 主要试剂

4.1.3 PCR 引物

4.1.4 培养基和培养条件

4.1.5 主要仪器设备

4.1.6 基因操作

4.1.7 葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

4.1.8 重组酶的纯化

4.1.8.1 粗酶液的制备

4.1.8.2 DEAE–Sephacel 阴离子交换柱层析

4.1.8.3 HW-55F-Toyopearl 分子筛

4.1.9 重组酶的酶活性检测

4.1.10 葡聚糖酶酶活测定方法

4.1.11 重组酶的定性

4.2 结果与讨论

4.2.1 原核表达质粒的构建

4.2.2 重组β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中的表达

4.2.3 重组β-葡萄糖苷酶的纯化

4.2.4 重组β-葡萄糖苷酶的定性

4.2.4.1 酶分子质量的测定

4.2.4.2 重组β-葡萄糖苷酶的最适反应条件

4.2.4.3 重组β-葡萄糖苷酶的的稳定性

4.2.4.4 金属离子、螯合剂和去污剂对重组β-葡萄糖苷酶的影响

4.2.4.5 重组β-葡萄糖苷酶的底物特异性

4.2.4.6 重组β-葡萄糖苷酶的酶促反应的动力学

4.3 讨论

4.3.1 重组β-葡萄糖苷酶的克隆

4.3.2 重组β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中的表达

4.3.3 重组β-葡萄糖苷酶的纯化和定性

4.4 小结

参考文献

第五章 几丁质脱乙酰酶的克隆与表达

5.1 材料和方法

5.1.1 菌株与质粒

5.1.2 主要试剂

5.1.3 主要仪器设备

5.1.4 培养基和培养条件

5.1.5 基因操作

5.1.6 序列比对

5.1.7 全长CDA 基因的获得

5.1.8 大肠杆菌重组表达载体的构建

5.1.9 几丁质脱乙酰酶基因在大肠杆菌中的表达

5.1.10 包含体试验

5.1.11 几丁质脱乙酰酶酶活测定

5.1.11.1 反应底物 Glycol chitin 的制备

5.1.11.2 几丁质脱乙酰酶酶活测定

5.1.11.3 标准曲线

5.2 结果与讨论

5.2.1 已知阿拉伯糖苷酶基因的序列比对

5.2.2 获得的几丁质脱乙酰酶基因的部分序列及其分析

5.2.3 全长几丁质脱乙酰酶基因的获得

5.2.4 草菇几丁质脱乙酰酶的序列分析

5.2.5 原核高效表达质粒的构建和转化子的鉴定分析

5.2.6 几丁质脱乙酰酶在大肠杆菌中的表达

5.2.6.1 蛋白电泳检测

5.2.6.2 包涵体实验

5.2.6.3 活性检测

5.3 讨论

5.3.1 全长CDA基因的获得

5.3.2 几丁质脱乙酰酶在大肠杆菌中的表达

5.4 小结

参考文献

论文主要结论

论文创新点

致谢

攻读博士期间发表的论文清单

附录

发布时间: 2006-07-20

参考文献

• [1].木聚糖酶基因的克隆、表达与酶学性质研究[D]. 张桂敏.华中农业大学2006
• [2].不同环境中木聚糖酶基因多样性分析及宏基因组来源的新基因克隆与表达[D]. 王国增.中国农业科学院2011
• [3].枯草芽孢杆菌BE-91木聚糖酶基因多样性及其克隆与表达研究[D]. 徐君飞.湖南农业大学2010
• [4].木聚糖酶基因的体外定向进化及其高拷贝重组酵母的构建[D]. 王谦.浙江大学2012
• [5].宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆、表达及定向诱变研究[D]. 周晨妍.江南大学2008
• [6].云南腾冲热泉嗜热原核微生物资源挖掘和高温木聚糖酶筛选[D]. 明红.云南大学2015
• [7].生物脱胶关键酶基因的克隆和串联表达[D]. 程毅.中国农业科学院2015
• [8].链霉菌来源的木聚糖降解酶相关基因的克隆及酶学性质研究[D]. 李宁.中国农业科学院2009

相关论文

• [1].草菇低温应答研究[D]. 陈明杰.南京农业大学2000
• [2].松乳菇菌丝纯培养及其分离物的DNA指纹研究[D]. 周国英.中南林学院2002
• [3].食用菌抗病毒蛋白的特性、基因克隆与表达[D]. 付鸣佳.福建农林大学2002
• [4].抗冷冻蛋白基因（THP）遗传转化草菇的研究[D]. 郭丽琼.华南热带农业大学2003
• [5].木聚糖酶蛋白质序列分析、分子进化和分子模拟[D]. 刘亮伟.江南大学2005
• [6].小麦全长cDNA文库构建、测序与分析[D]. 赵光耀.中国农业科学院2006
• [7].渗透胁迫下白花柽柳SSH文库构建及质膜水孔蛋白基因克隆[D]. 董玉芝.东北林业大学2006
• [8].白桦花期抑制性消减文库的构建及花发育相关基因的克隆[D]. 魏继承.东北林业大学2006
• [9].阿拉伯木聚糖溶解、降解机制的研究及酸性木聚糖酶基因的克隆、表达[D]. 李胤.江南大学2006
• [10].草菇冷诱导相关基因的克隆及分析[D]. 孙晓红.南京农业大学2006

标签：草菇论文;  削减文库论文;  差异杂交论文;  木聚糖酶论文;  葡萄糖苷酶论文;  几丁质脱乙酰酶论文;  克隆论文;  表达论文;  大肠杆菌论文;  毕赤酵母论文;  重组酶论文;  纯化论文;  酶学性质论文;