低温诱导的马铃薯块茎特异融合启动子的构建及低温调控因子St-CBF的鉴定

论文摘要

马铃薯是世界第四大粮食作物,其块茎除用作鲜食外,还作为工业原料加工各种食品和其它淀粉产品,其中薯片和薯条等加工产品的生产在马铃薯加工业中占据重要位置。为了延长加工周期,低温贮藏是最经济有效的方法,然而低温导致还原糖的大量累积,使得在高温油炸时还原糖与自由氨基酸发生褐化反应,严重影响了加工产品的品质。马铃薯油炸加工品质改良的基因工程目前已作为重要的育种途径在国内外展开研究,为使目的基因在不干扰马铃薯正常生长而只在贮藏期间低温诱导表达,低温诱导的块茎特异表达启动子成为油炸加工品质基因工程育种的迫切需要。本研究在克隆相关低温诱导表达基因启动子的基础上,构建具有低温诱导活性的块茎特异表达融合启动子,评价其在马铃薯基因工程中潜在的应用价值。并在此基础上,对马铃薯中调控低温诱导启动子活性的蛋白质因子进行了初步研究,取得的主要研究结果如下:1.低温启动子诱导活性分析:采用PCR方法分别从拟南芥和马铃薯中克隆了低温诱导cor15α基因的启动子和ci21A基因的启动子。序列比较分析显示,cor15α基因的启动子含有目前研究确定的低温响应元件“LTRE”,而ci21A基因的启动子中没有该元件。将cor15α基因启动子和ci21A基因启动子分别与GUS基因连接,构建了表达载体pLB和pCI21A,采用根癌农杆菌介导的转化技术转化烟草并获得转基因植株。转基因烟草的GUS染色和GUS活性荧光定量分析结果显示,cor15α基因启动子和ci21A基因启动子在烟草中都具有表达功能,总体表达强度分析显示,ci21A基因启动子表达强度高于cor15α基因启动子,但cor15α基因启动子对低温诱导的敏感性强于ci21A基因启动子。2.cor15α基因启动子在马铃薯中表达活性鉴定:为了检测cor15α基因启动子在马铃薯中是否具有低温诱导活性,本研究将表达载体pLB通过农杆菌介导转化马铃薯“鄂马铃薯3号（E3）”并获得转化再生植株。转基因马铃薯的GUS染色和GUS活性荧光定量分析结果证明,cor15α基因启动子在马铃薯中仍具有低温诱导表达特性。在没有低温处理的对照组中,各被测样品组织中均检测不到GUS的酶活性,低温处理后,在茎,叶,块茎和匍匐茎组织中均可以检测到不同强度的GUS活性,其中叶片和块茎中的活性相对较高。3.cor15α基因启动子和块茎特异启动子（CIPP）的特异核心启动子区域表达活性鉴定:实验将cor15α基因启动子的-297/+70（含有一个低温响应元件LTRE）与GUS基因连接,构建了转化载体pL297-121,将CIPP启动子的-340/+19（含有块茎特异表达调控序列TSSR）与GUS基因连接,构建了转化载体pC340-121。pL297-121和pC340-121分别转化马铃薯E3获得转基因植株,分析显示,载体pL297-121在除根以外所有被检测的组织中均具有低温诱导表达功能,但表达强度低于完整cor15α基因启动子。pC340-121在块茎中的表达活性明显高于茎,根和匍匐茎,而在叶片中则始终未检测到它的活性。同时低温处理后,pC340-121的活性在所有被测组织中均没有变化,表明该TSSR序列的调控活性不受低温环境的影响。4.低温诱导的马铃薯块茎特异启动子构建与表达功能鉴定:以低温诱导cor15α基因的启动子和马铃薯块茎特异启动子CIPP为基础,采用重叠延伸PCR的方法,将cor15α基因启动子中含有低温响应元件LTRE的-297/-42和-297/+70片段分别与CIPP启动子中含有块茎特异表达序列TSSR的-340/+19和-340/-28片段进行融合,按照核心序列相对于TATA-box位置的不同,构建了2个融合启动子pCL（TSSR靠近TATA-box）和pLC（LTRE靠近TATA-box）,并将2个融合启动子分别与GUS基因连接,通过农杆菌介导的基因转化,将融合启动子pCL和pLC导入E3获得转基因植株。分析结果显示,融合启动子pCL和pLC均具有表达功能,但核心功能序列相对于TATA-box的位置不同其表达强度具有显著差异。块茎特异表达序列TSSR靠近TATA-box的pCL,GUS表达强度显著高于低温诱导核心启动子序列LTRE靠近TATA-box的pLC,特别是在块茎和匍匐茎中表现更为突出。5.马铃薯St-CBF转录因子的鉴定:本研究根据已报道的EST序列设计引物,采用基于PCR的技术从马铃薯两个基因型（E3和CW2-1）中克隆到St-CBF基因的蛋白质编码区序列。序列分析显示该片段长600bp,编码199个氨基酸,具有CBF/DREB转录因子的保守结构域ERF/AP2,同时还具有一个富含丝氨酸/苏氨酸的保守区域,一个核定位信号NLS（PKRPAGRKKFRETRHP）和一个保守的DSAW-Motif。该St-CBF具备CBF1/DREB1类转录因子的典型特征。氨基酸序列比对分析表明,St-CBF与许多植物中的CBF/DREB转录因子蛋白具有较高的同源性。将St-CBF基因克隆到pGEX-6P-1上与谷胱苷肽-S-转移酶进行融合,并在大肠杆菌中BL21（DE3）中成功进行了融合蛋白的表达。凝胶阻滞实验表明,该融合蛋白能够与cor15α基因启动子中的LTRE序列发生特异地结合,初步证明马铃薯St-CBF蛋白具有CBF/DREB类转录因子的功能。Southern杂交显示St-CBF基因在马铃薯基因组中只有一个位点。RT-PCR结果显示St-CBF基因在低温处理15min即开始在叶片中表达,而且在整个低温处理期间（12h）持续表达,表明马铃薯St-CBF基因可能参与调节低温诱导基因的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 马铃薯概述
• 1.2 马铃薯块茎低温糖化机理及抗低温糖化改良
• 1.2.1 植物细胞低温糖化的普遍性
• 1.2.2 马铃薯块茎低温糖化的生物化学机制
• 1.2.3 马铃薯抗低温糖化育种可能的突破点
• 1.3 低温胁迫与植物低温抗性研究进展
• 1.3.1 低温胁迫下植物细胞生理的变化
• 1.3.2 植物细胞应对低温胁迫的渗透调节
• 1.3.3 低温诱导表达基因研究
• 1.3.3.1 低温诱导基因的分离鉴定
• 1.3.3.2 COR基因的功能
• 1.3.3.3 COR基因的调控
• 1.4 植物启动子研究
• 1.4.1 植物启动子的基本结构及其功能
• 1.4.1.1 TATA盒
• 1.4.1.2 超始因子
• 1.4.1.3 CAAT-box
• 1.4.1.4 G-box
• 1.4.2 启动子的类型
• 1.4.2.1 组成型启动子
• 1.4.2.2 诱导型启动子
• 1.4.2.3 组织特异型启动子
• 1.4.3 真核生物融合启动子研究进展
• 1.4.3.1 融合启动子的类型
• 1.4.3.2 影响融合启动子活性的因素
• 1.4.3.3 融合启动子研究的意义与展望
• 1.5 本研究的目的,意义和主要内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种和质粒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒的小量提取
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.3 农杆菌感受态的制备及转化
• 2.2.4 农杆菌介导的植物遗传转化
• 2.2.4.1 农杆菌介导的烟草转化
• 2.2.4.2 农杆菌介导的马铃薯试管薯的遗传转化
• 2.2.5 植物基因组DNA的提取
• 2.2.5.1 叶片DNA小量抽提（用于PCR）
• 2.2.5.2 植物DNA的大量抽提与纯化（用于Southern杂交）
• 2.2.6 马铃薯叶片RNA的提取
• 2.2.7 cDNA第一链的合成
• 2.2.8 转基因植株的Southern杂交
• 2.2.8.1 总DNA的预酶切和酶切
• 2.2.8.2 电泳转膜
• 2.2.8.3 预杂交
• 2.2.8.4 探针标记
• 2.2.8.5 杂交
• 2.2.8.6 洗膜与放射性自显影
• 2.2.9 GUS活性测定
• 2.2.9.1 植物组织的GUS染色
• 2.2.9.2 GUS活性的荧光定量测定
• 2.2.10 蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.10.1 基本原理
• 2.2.10.2 器材
• 2.2.10.3 试剂
• 2.2.10.4 操作步骤
• 2.2.11 凝胶电泳迁移率实验（EMSA）
• 2.2.11.1 基本原理
• 2.2.11.2 试剂的配制
• 2.2.11.3 凝胶电泳迁移率实验方法
• 第三章 cor15α基因启动子与ci21A基因启动子低温诱导活性的比较研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 菌种和质粒
• 3.2.3 酶和试剂
• 3.2.4 常规DNA操作
• 3.2.5 cor15α基因启动子片段的PCR扩增
• 3.2.6 ci21A基因启动子的PCR扩增
• 3.2.7 表达载体pLB和pCI21A的构建
• 3.2.8 烟草的遗传转化及植株再生
• 3.2.9 烟草转化植株的PCR检测和Southern杂交鉴定
• 3.2.10 转基因烟草的低温处理和GUS组织化学染色
• 3.2.11 GUS活性的荧光定量测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 cor15α基因启动子的PCR扩增及启动子序列
• 3.3.2 ci21A基因启动子的PCR扩增及启动子序列
• 3.3.3 遗传转化载体pLB的构建
• 3.3.4 遗传转化载体pCI21A的构建
• 3.3.5 转基因烟草植株的获得
• 3.3.6 转基因烟草植株的PCR和Southern杂交鉴定
• 3.3.7 cor15α基因启动子与ci21A基因启动子在烟草中的表达特点
• 3.3.8 cor15a基因启动子与ci21A基因启动子在烟草中的低温诱导活性
• 3.4 讨论
• 第四章 拟南芥低温诱导cor15α基因启动子在马铃薯中的功能
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 菌种和质粒
• 4.2.3 马铃薯的遗传转化及植株再生
• 4.2.4 马铃薯转化植株的PCR和Southern杂交鉴定
• 4.2.5 转基因马铃薯的低温处理及GUS组织化学染色
• 4.2.6 GUS荧光定量测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 马铃薯转化植株的获得
• 4.3.2 转基因植株的PCR和Southern杂交鉴定
• 4.3.3 cor15α基因启动子在转基因马铃薯叶片中的低温诱导表达
• 4.3.4 cor15α基因启动子在转基因马铃薯不同组织中的GUS活性检测
• 4.4 讨论
• 第五章 块茎特异和低温诱导融合启动子的构建及在马铃薯中的功能
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 植物材料,菌株和培养基
• 5.2.2 融合启动子pCL和pLC的构建
• 5.2.3 马铃薯转化载体的构建
• 5.2.4 马铃薯的遗传转化
• 5.2.5 转基因植株的PCR筛选和Southern杂交分析
• 5.2.6 转基因马铃薯的低温处理和GUS酶活性荧光分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 融合启动子pCL和pLC的构建
• 5.3.2 马铃薯转化载体的构建
• 5.3.3 马铃薯的遗传转化及转化植株的获得
• 5.3.4 转化植株的PCR筛选和Southern杂交鉴定
• 5.3.5 融合启动子在马铃薯中的表达活性和低温诱导性
• 5.4 讨论
• 第六章 马铃薯CBF/DREB类转录因子基因的克隆,原核表达及其与LTRE的结合功能研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 植物材料与低温处理
• 6.2.2 菌种和质粒
• 6.2.3 马铃薯叶片总RNA的抽提及cDNA第一链的合成
• 6.2.4 马铃薯CBF/DREB基因蛋白质编码区的PCR扩增
• 6.2.5 蛋白质编码区的序列分析及同源基因的比较
• 6.2.6 GST融合蛋白表达载体的构建
• 6.2.7 融合蛋白的诱导表达及检测
• 6.2.8 可溶性GST融合蛋白的提取和纯化
• 6.2.9 融合蛋白与启动子调控序列之间的互作研究
• 6.2.10 CBF/DREB基因的拷贝数分析
• 6.2.11 CBF/DREB基因表达模式分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 马铃薯CBF/DREB基因的PCR扩增
• 6.3.2 基因的序列分析
• 6.3.3 GST融合蛋白表达载体的构建
• 6.3.4 GST融合蛋白的表达
• 6.3.5 可溶性GST融合蛋白的提取和纯化
• 6.3.6 GST融合蛋白的结合功能分析
• 6.3.7 St-CBF基因在E3和CW2-1基因组中拷贝数
• 6.3.8 St-CBF基因在E3和CW2-1中的表达模式
• 6.4 讨论
• 第七章 讨论
• 7.1 启动子选择与马铃薯基因工程
• 7.2 融合启动子研究
• 7.3 CBF/DREB类转录因子与马铃薯基因工程改良
• 7.4 后续研究展望
• 7.4.1 低温诱导和块茎特异表达融合启动子的构建研究
• 7.4.2 St-CBF基因的研究
• 参考文献
• 附录A:载体pLB和pCI21A的构建路线图
• 附录B:融合启动子pLC和pCL的构建路线图
• 附录C:表达载体pGCK8603的构建路线图
• 附录D:融合启动子pCL GenBank登记信息
• 附录E:融合启动子pLC GenBank登记信息
• 附录F:低温诱导的启动子LTP GenBank登记信息
• 附录G:发表和已经准备的论文
• 致谢