栉孔扇贝（Chlamys farreri）性别分化相关基因的筛选以及两个相关基因的表达分析

论文摘要

性别分化是发育生物学研究的重要内容之一,性别分化相关基因的研究在脊椎动物特别是哺乳动物中较为深入,目前已经发现了Sry、Sox9、Wnt4等诸多与性别决定和分化有关的基因;但在无脊椎动物特别是海洋贝类中相关的研究尚处于起步阶段。本研究选取我国重要的水产经济贝类——栉孔扇贝（Chlamys farreri）为研究对象,采用Solexa测序技术对其增殖期精卵巢的差异表达谱进行了分析,获得了295262个在精卵巢中差异表达的Tag,其中1354个Tag可以在GenBank数据库中得以注释。选择其中的5条核酸序列进行了半定量RT-PCR验证,发现solexa测序结果与半定量结果的一致率为40%。采用RACE技术对其中的CL3256序列进行全长cDNA扩增,序列比对初步判定其为核糖体蛋白24基因,定名为Cf-rlp24。该基因全长cDNA为965 bp,开放阅读框为525 bp,编码175个氨基酸,该推测蛋白在不同物种之间同源性很高。Real-time PCR检测Cf-rlp24基因在精、卵巢之间以及不同发育时期的精巢中均存在表达差异,其中生长期和成熟期精巢Cf-rlp24基因的表达量显著高于相应时期的卵巢,分别高出2.200±0.446倍和6.036±1.283倍;在精巢的发育过程中,该基因的表达呈逐渐升高的态势,至成熟期时达最高值,而后迅速回落;但在卵巢的发育过程中,始终处于较低的表达水平,且未见该基因的显著性表达差异。我们得出,Cf-rlp24基因参与栉孔扇贝性腺的发育,且在精巢发育中的作用大于卵巢。本研究我们还采用Real-time PCR技术,分析了栉孔扇贝卵黄蛋白原基因（Cf-vtg）在两性性腺发育周期以及肝胰腺中的表达,得出该基因主要在卵巢中表达,且其表达量随着卵巢的发育成熟而逐渐升高,生长期和成熟期Cf-vtg基因的表达量分别为增殖期的1.917±0.035和2.570±0.252倍。休止期卵巢该基因几乎没有表达。进一步我们发现Cf-vtg基因在肝胰腺中也有少量的表达,其表达量为增殖期卵巢中的0.045±0.009。该基因在精巢中几乎没有表达。进一步我们采用注射的方法,检测了17β-E2对扇贝Cf-vtg基因的诱导表达,real-time PCR结果显示,17β-E2可明显诱导Cf-vtg基因的表达。因此推测17β-E2可以促进栉孔扇贝扇贝Cf-VTG的合成。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 性别决定与性别分化机制
• 1.1 脊椎动物的性别决定与分化机制
• 1.2 无脊椎动物的性别决定与分化机制
• 1.3 核糖体蛋白相关研究现状
• 1.4 卵黄蛋白原相关研究现状
• 2 DNA 测序技术
• 2.1 第一代测序技术
• 2.2 第二代测序技术
• 2.3 高通量测序技术的发展趋势
• 3 本研究的目的及意义
• 第二章 栉孔扇贝性别分化相关基因筛选和初步验证
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 雌雄性腺总RNA 质量
• 2.2 Solexa 测序结果
• 2.3 RT-PCR 检测雌雄两性差异基因
• 3 讨论
• 第三章 栉孔扇贝核糖体蛋白 L24 基因的克隆及表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 Cf-rlp24 基因全长cDNA 序列的克隆
• 2.2 Cf-rlp24 基因氨基酸序列比对及系统进化分析
• 2.3 性腺发育周期中Cf-rlp24 基因的表达
• 3 讨论
• 第四章 栉孔扇贝卵黄蛋白原基因的表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 性腺发育周期中Cf-vtg 基因的表达
• 2.2 卵巢及肝胰腺中Cf-vtg 基因的表达
• 2.3 Cf-vtg 基因表达的原位杂交分析
• 2.4 17β-E2 诱导后性腺中Cf-vtg 基因的表达
• 3. 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文