论文摘要
大蒜（Allium sativum L.）为百合科（Liliacaea）葱属（Allium）植物，栽培历史悠久。大蒜的基因组庞大，是所有真核生物中基因组最大的物种之一。大蒜是遗传研究和基因组信息相对缺乏的物种。目前在公共数据库中可以利用的基因组信息非常有限。大蒜鳞茎具有自然的生理休眠特性，该特性对大蒜生产及产品贮藏有重要影响。大蒜鳞茎收获后，在自然条件下经历60d-80d的休眠期，即可解除休眠，鳞芽开始萌动，伴随着一系列的物质代谢活动，导致大蒜鳞茎水分及各营养组分含量下降，品质降低。因此，大蒜萌发特性与大蒜产业的健康发展密切相关。核因子Y（Nuclear factor Y）是一类重要的转录因子，可以与CCAAT框结合并控制基因的表达，广泛分布于酵母、哺乳动物及植物细胞中。核因子Y由三个不同的亚基组成：NF-YA、NF-YB和NF-YC。NF-YB是植物发育调控网络中的一个关键枢纽，但是到目前为止对其表达调控的了解还相当有限。本研究利用高通量测序技术对大蒜的转录组进行了测序。对萌发期和休眠期的差异表达基因进行了分析。克隆得到了大蒜中的NF-YB3基因，对其表达模式和功能进行了分析。主要结果如下：（1）利用Illumina高通量测序技术对大蒜休眠鳞芽和萌发鳞芽的转录组进行测序,得到26,666,668条90bp的序列。测序所得的Clean reads经组装软件SOAPdenovo组装成了Unigene。对休眠芽测序后得到75,226个Unigene，对萌发芽测序后得到81,126个Unigene。对所得到的Unigene进一步序列拼接和去冗余处理后得到了非冗余Unigene127,933个，序列长度从200bp到2300bp，其中长度大于500bp的有33,568条。（2）通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG（evalue<0.00001），共有45,284条unigene获得了基因注释。其中45,286个unigenes在nr蛋白数据库中获得注释，29,514个unigenes在Swiss-Prot蛋白数据库中获得注释。（3）根据nr注释信息获得了unigene的GO分类信息。13,325条unigene归入生物学过程（biological process），22,845条unigene归入细胞组分（cellular component），10,526条unigene归入分子功能（molecular function）。在GO分类体系中分子功能、生物学过程和细胞组分3个大的类别被划分为更详细的45个小的类别,这一分类结果显示了大蒜鳞茎基因表达谱的总体情况。（4）将Unigene与COG数据库进行了比对，21,952个Unigene在COG数据库中获得了功能分类。3,164个Unigene被归为R类（transcription），占总数的14.41%。1,888个Unigene被归为K类（general function prediction only），占总数的14.41%。1,877个Unigene被归为K类（general function prediction only），占总数的14.41%。（5）根据KEGG注释信息得到了Unigene的Pathway注释。有20,706条Unigene归属到125个具体的生化途径中。在代谢途径（metabolic pathways）中获得注释的Unigene数量最多，有5206个，占25.14%。其次为剪接体（Spliceosome），有1329个Unigene，占6.42%。第三大类为植物与病原物的互作，有1458个Unigene，占5.86%。（6）在休眠期和萌发期大蒜鳞芽中共得到45,362个差异表达基因，其中在萌发期上调表达的有22,836个，下调表达的有22,526个。7784个Unigene只在萌发期表达，7975个Unigene只在休眠期表达。在休眠鳞芽中热激蛋白，分子伴侣和逆境相关基因所占比例最大。在萌发期上调表达的基因中碳水化合物代谢、转录、膜转运、细胞分裂和生长的基因所占比例最大。（7）从大蒜中分离出AsNF-YB3基因，AsNF-YB3基因的开放阅读框为633bp，编码211个氨基酸。序列分析表明，该基因所编码的蛋白质中含有典型NF-YB结构域。与GenBank中注册的NF-YB基因高度同源，属于NF-YB家族的基因。AsNF-YB3基因在大蒜根、鳞茎、叶、蒜苔、花中均有表达，不具有器官特异性。AsNF-YB3基因的表达量与内芽萌发密切相关，AsNF-YB3在大蒜内芽萌发中起重要作用。（8）构建了真核表达载体AsNF-YB3，将表达载体转化到农杆菌，利用叶盘法转化烟草，得到了转基因烟草植株。构建了原核表达载体AsNF-YB3，并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白，免疫小白鼠，制备抗体。Western杂交表明，转基因植株中AsNF-YB3基因已在蛋白水平过量表达。转AsNF-YB3基因延长了种子的休眠期。过表达AsNF-YB3基因促进了幼苗主根的伸长。过表达AsNF-YB3基因促进了转基因烟草植株的快速生长，同龄烟草植株叶片数目多，节间数也多。过表达AsNF-YB3基因提早了烟草开花、结实时间，缩短了生育期。