基于纳米探针技术的DNA杂交分析与免疫分析方法研究

论文摘要

DNA杂交分析及免疫分析在生命科学研究中具有重要的意义,广泛应用于生物学、医学诊断等方面。已有分析方法的局限性促使研究者们积极的研究普遍适用性好、操作简便、灵敏度高的DNA杂交检测及免疫检测新方法。本文将纳米探针技术与高灵敏化学发光技术结合应用于DNA杂交检测及免疫检测,对特定序列的寡聚核苷酸,人IgG及黄曲霉毒素B1进行了超微量检测,取得了令人满意的结果。以CoFe2O4/Au核壳复合纳米颗粒标记巯基化沙门氏菌特异寡核苷酸序列,用纳米金标记沙门氏菌另一特异寡核苷酸序列,通过DNA杂交反应与沙门氏菌特异目标DNA序列互补形成夹心结构。经过简单的磁分离,去除其他没有杂交的部分,最后将磁分离得到部分的纳米金溶出成为Au3+,结合luminol化学发光体系实现对目标DNA的高灵敏检测。结果表明,发光强度和目标DNA浓度在1-100 pmol·L-1范围内相关性良好,对目标DNA的检测限为0.3 pmol·L-1（3S/N）,相对标准偏差为3.6%(10 pmol·L-1, n=7)。同时以CoFe2O4/Au核壳复合纳米颗粒为载体与羊抗人IgG构建捕获探针复合结构,首先与目标分析物人IgG发生免疫反应,捕获的人IgG再与纳米金标记的二抗（金标羊抗人IgG）发生免疫反应,形成三明治夹心结构;通过磁分离去除未结合物质干扰,将分离得到的标记纳米金溶出成为Au3+,结合Au3+催化luminol化学发光分析方法实现对目标分析物人IgG的高灵敏检测。在实验优化条件下,化学发光强度与人IgG的浓度在2-100 ng·mL-1范围内呈良好的线性关系,检测限为0.5 ng·mL-1。黄曲霉毒素B1的快速灵敏检测在食品安全检测工作中具有重要意义。本文建立了两种基于银增强纳米金标记探针的高灵敏度免疫分析方法。第一种方法用黄曲霉毒素B1（AFB1）抗体与金标抗原、待测抗原进行竞争免疫反应,然后加入银增强溶液,以金为核沉积生长银,通过检测吸光度来确定待测物中AFB1的含量,该方法的检出限可达到0.01 ng·mL-1。第二种方法在前一种方法的基础上,将银化学溶出,通过化学发光法检测沉积的银的量来确定待测物中AFB1的含量,该方法的检出限可达到0.002 ng·mL-1。论文还建立了纳米金标记-银增强-化学发光联用检测沙门氏菌的新方法。通过沙门氏菌捕获探针、金标沙门氏菌显示探针与沙门氏菌目标核酸序列之间的DNA杂交,形成三明治复合体,然后通过银增强在标记的纳米金表面选择性沉积银,实现第一次信号放大;随后结合溶出化学发光检测技术,实现信号第二次放大。结果表明,在优化条件下,化学发光强度和目标DNA浓度在1-1000 fmol·L-1范围内相关性良好,对目标DNA的检测限为0.3 fmol·L-1（3S/N）,相对标准偏差为2.2%(10 fmol·L-1, n=7)。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 纳米探针概述
• 1.1.1 纳米粒子
• 1.1.2 纳米探针
• 1.2 纳米探针在DNA 杂交分析与免疫分析中的应用
• 1.2.1 纳米探针在DNA 杂交分析中的应用
• 1.2.2 纳米探针在免疫分析中的应用
• 1.3 磁性纳米粒子与生物磁分离
• 1.3.1 磁性纳米粒子
• 1.3.2 生物磁分离
• 1.4 纳米金标记—银增强技术
• 1.4.1 免疫金银染色法（IGSS）的光镜应用
• 1.4.2 银强化斑点免疫金渗滤分析
• 1.4.3 电化学分析
• 1.4.4 光谱分析
• 1.5 化学发光分析
• 1.5.1 化学发光简介
• 1.5.2 化学发光在核酸检测分析中的应用
• 1.5.3 化学发光在免疫分析中的应用
• 1.6 研究课题的立题意义与研究内容
• 第二章 基于纳米金标记-磁分离-化学发光检测的沙门氏菌DNA 杂交分析方法研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料与主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2O₄/Au 复合磁性纳米材料的制备'>2.2.3 CoFe₂O₄/Au 复合磁性纳米材料的制备
• 2.2.4 纳米金的制备
• 2.2.5 纳米金寡核苷酸功能化
• 2O₄/Au 复合磁性纳米粒子寡核苷酸功能化'>2.2.6 CoFe₂O₄/Au 复合磁性纳米粒子寡核苷酸功能化
• 2.2.7 寡核苷酸杂交
• 2.2.8 金的化学溶出与化学发光检测
• 2.2.8.1 金化学溶出条件的优化
• 2.2.8.2 金溶出化学发光检测
• 2.3 结果与分析
• 2O₄/Au 复合磁性纳米材料的表征'>2.3.1 CoFe₂O₄/Au 复合磁性纳米材料的表征
• 2.3.2 纳米金的表征
• 2.3.3 纳米金化学溶出及化学发光检测条件的优化分析
• 2、NaCl 的浓度的影响'>2.3.3.1 HCl、Br₂、NaCl 的浓度的影响
• 2.3.3.2 luminol 浓度的影响
• 2.3.4 化学发光检测
• 2.3.5 特异性评价
• 2.4 结论
• 第三章 基于纳米金标记-磁分离-化学发光检测的人免疫球蛋白G 免疫分析方法研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料与主要试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 纳米材料的制备与表征
• 3.2.4 纳米金标记羊抗人IgG
• 2O₄/Au 磁性复合纳米材料标记羊抗人IgG'>3.2.5 CoFe₂O₄/Au 磁性复合纳米材料标记羊抗人IgG
• 3.2.6 金化学溶出条件以及化学发光条件的优化
• 3.2.7 化学发光免疫分析
• 3.2.8 人血清样品中的IgG 测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 分析性能
• 3.3.2 分析应用
• 3.4 结论
• 第四章 基于纳米金标记-银增强-化学发光检测的黄曲霉毒素81免疫分析方法研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料与主要试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 纳米金的制备
• 1 酶标抗原复合物制备'>4.2.4 纳米金标记AFB₁酶标抗原复合物制备
• 4.2.5 金标抗原直接竞争免疫反应过程
• 4.2.6 银增强及吸光度值的检测
• 4.2.7 化学发光检测条件优化
• 2S₂O₈ 浓度的优化'>4.2.7.1 K₂S₂O₈浓度的优化
• 4 浓度的优化'>4.2.7.2 MnSO₄浓度的优化
• 3 浓度的优化'>4.2.7.3 HPO₃浓度的优化
• 4.2.7.4 luminol 浓度的优化
• 4.2.8 银的化学溶出与化学发光检测
• 4.2.9 样品制备
• 4.2.10 酶联免疫吸附对照实验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 银增强及吸光度值的检测
• 4.3.2 银的化学溶解
• 4.3.3 化学发光检测条件优化
• 4.3.4 分析性能
• 4.3.5 分析应用
• 4.4 结论
• 第五章 基于纳米金标记-银增强-化学发光检测的沙门氏菌DNA杂交分析方法研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料与主要试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 纳米金的制备与表征
• 5.2.4 纳米金标记核酸探针的制备
• 5.2.5 酶标板包被亲和素
• 5.2.6 寡核苷酸杂交
• 5.2.7 银增强
• 5.2.8 吸光度检测
• 5.2.9 溶出化学发光检测体系的条件优化
• 5.2.10 银的化学溶出与化学发光检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 酶标板包被亲和素
• 5.3.2 银增强
• 5.3.3 银的化学溶解
• 5.3.4 分析性能
• 5.3.5 特异性评价
• 5.4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文