照射的半相合淋巴细胞输注抗肿瘤作用的机理研究

论文摘要

供者淋巴细胞输注（DLI）作为一种成熟的治疗方法,常应用于骨髓移植（BMT）后,用来放大移植物抗肿瘤（GvT）的作用。最近研究者们将DLI应用于未进行骨髓移植的肿瘤患者中,发现大剂量化疗预处理后,应用DLI可以诱发GvT效应,但这种效应同时伴随严重移植物抗宿主病（GvHD）的产生,威胁到患者的生命。60Co照射可以在限制淋巴细胞增殖同时保留淋巴细胞杀伤毒性,从而限制GvHD的产生。在先前的研究中,我们应用C57BL/6（H-2b）→CB6F1(H-2b/d)的小鼠骨髓移植模型,输注经照射的小鼠脾加骨髓细胞,发现骨髓移植后可以诱发GvT,同时降低GvHD的产生。但未经骨髓移植,单纯输注半相合淋巴细胞是否能诱发抗肿瘤作用,尚不明确。在本研究中,我们采用C57BL/6（H-2b）→CB6F1(H-2b/d)半相合淋巴细胞输注模型,探讨半相合淋巴细胞在经60Co照射后,是否具备在小鼠体内直接诱发GvT的能力;采用CB6F1(H-2d/k)→CC3HF1(H-2b/d)半相合淋巴细胞输注模型,探讨半相合淋巴细胞在经60Co照射后,单纯输注经照射的小鼠淋巴细胞,这种抗肿瘤作用来源于GvT还是HvT,以及其可能的作用机制。本研究主要由3部分组成:①CB6F1小鼠荷瘤模型的建立及不同剂量照射对供者鼠淋巴细胞的影响;②照射的半相合淋巴细胞的GvT作用研究(H-2b→H-2b/d输注模型);③探讨经照射的半相合淋巴细胞输注的抗肿瘤作用及其机制(H-2d/k→H-2b/d模型)。一、CB6F1小鼠荷瘤模型的建立及照射对供者鼠淋巴细胞的影响目的1.建立稳定的、可供照射的半相合淋巴细胞输注研究的小鼠模型。2.观察不同照射剂量对供者淋巴细胞的影响。方法1. SPF级健康雌性BALB/c×C57BL/6杂交F1代小鼠分为3组,每组5只,将C57BL/6来源的hepa 1-6肝癌细胞接种于CB6F1小鼠皮下,每3天观察接种hepa 1-6细胞后,F1小鼠肿瘤的生长情况,测量小鼠体重变化、肿瘤大小,探索hepa 1-6细胞在F1小鼠的成瘤性;取小鼠实体瘤、肝、肠、肺进行病理学观察。2.取8-10周、雌性的SPF级小鼠BALB/c、CC3HF1(BALB/c×C3H H-2d/k),处死后取小鼠脾脏,制成单细胞悬液,分为6组,分别用60Co照射0、2.5、5、7.5、15、25Gy,MTT（3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-diphenytetrazoliumrom）法检测不同剂量照射对细胞增殖的影响,LDH（Lactic Dehydrogenase）法检测不同剂量照射对细胞杀伤能力的影响。结果1.每只CB6F1小鼠右腋皮下接种4×106个hepa 1-6细胞3、4天后,肿瘤开始长出,成瘤率为100%,接种后肿瘤生长速度尚均匀,各组之间差异无统计学意义。肿瘤无自发缓解,全部小鼠死于肿瘤。病理学检查证实小鼠的皮下肿瘤组织为低分化癌,肺脏见转移瘤,其它脏器未见转移瘤。2.淋巴细胞的增殖对照射敏感,小剂量的照射就可以影响淋巴细胞增殖。在淋巴细胞杀伤能力检测中,未发现照射对淋巴细胞的杀伤活性有显著影响。与未照射组比较,照射剂量>5 Gy就可以显著抑制淋巴细胞的增殖。结论1. C57BL/6来源的hepa 1-6细胞可以在与其半相合的CB6F1小鼠身上稳定成瘤。2.照射可以抑制淋巴细胞的增殖,但对其杀伤活性影响较小。5 Gy就可以抑制淋巴细胞增殖。二、照射的半相合淋巴细胞的GvT作用研究目的1.探讨经实验最大照射剂量（25Gy）照射后,半相合淋巴细胞能否在小鼠体内直接诱发GvT效应及GvHD。2.探讨化疗预处理、MHC相合程度、供者T细胞在经照射半相合淋巴细胞输注诱发GvT中的地位。方法取8-10周、SPF级健康雌性CB6F1（BALB/c×C57BL/6）小鼠作为受者,BALB/c小鼠作为供者。受者荷瘤鼠分为6组:PBS组（尾静脉注射PBS）,CTX组（腹腔注射环磷酰胺）,TCD Sp/irr -BALB/c组（尾静脉输注去除T细胞的脾细胞）,Sp/irr-BALB/c组（尾静脉输注BALB/c小鼠脾细胞）,Sp/irr-C3H组（尾静脉输注C3H小鼠脾细胞）,CTX+Sp/irr-BALB/c组（腹腔输注CTX后,尾静脉输注BALB/c小鼠脾细胞）。每3天使用游标卡尺检测肿瘤大小并计算肿瘤体积,检测小鼠体重变化以及在输注治疗一天后,取荷瘤小鼠肝、肠、皮肤、脾脏做组织病理切片,并进行HE染色,检测有无GvHD产生。同时应用流式细胞术检测供者小鼠淋巴细胞在受者小鼠体内的生存时间,以及荷瘤小鼠淋巴细胞亚群的变化。结果经照射的半相合DLI后,供者鼠细胞能够在受者鼠体内存活13天。输注治疗可以有效的抑制肿瘤的生长,延长受者鼠的生存时间,而无明显GvHD。供者T细胞删除会损伤输注诱发的抗肿瘤疗效;化疗预处理联合经照射半相合DLI以及经照射完全不相合DLI均可获得更佳的抗肿瘤疗效。结论经照射的半相合DLI具备诱发GvT的能力,同时可抑制GvHD的产生。供者T细胞在输注诱发的GvT作用中扮演了重要角色;MHC不相合程度增加及应用化疗预处理都可提高照射的半相合DLI的GvT效应。三、照射的半相合淋巴细胞输注的抗肿瘤作用及机制目的在H-2d/k→H-2b/d输注模型中,观察照射的半相合供者淋巴细胞输注的抗肿瘤作用并探讨其可能的作用机制。方法取8-10周、SPF级健康雌性CB6F1（BALB/c×C57BL/6）小鼠作为受者,CC3HF1（BALB/c×CC3H）小鼠作为供者。受者荷瘤鼠分别分为5组:PBS组（尾静脉输注PBS）,CTX组（腹腔注射环磷酰胺）,Sp/irr组（尾静脉输注BALB/c小鼠脾细胞）,CTX+Sp/irr组（腹腔输注CTX后,尾静脉输注BALB/c小鼠脾细胞）,TCD Sp/irr组（尾静脉输注去除T细胞的脾细胞）。观察各组的抗肿瘤效应。每3天使用游标卡尺检测肿瘤大小并计算肿瘤体积。通过检测小鼠体重变化及取小鼠肝、肠、皮肤、脾脏做组织病理切片,检测有无GvHD产生。输注后3、10天每组处死5只小鼠,取小鼠脾脏,制成细胞悬液,LDH法进一步的检测输注后受者小鼠淋巴细胞的杀伤活性;同时,取受者小鼠血清,ELISA法检测Ⅰ型细胞因子IL-2、IFN-γ的水平。流式细胞术检测输注治疗后,供者小鼠淋巴细胞在受者小鼠体内的生存状况及受者小鼠淋巴细胞亚群的变化。结果经照射半相合的DLI后,在受者鼠体内的供者鼠细胞在4天内就被完全排斥掉,然而在这之后,仍然可观察到持续的抗肿瘤效应。输注治疗可以有效的抑制肿瘤的生长,延长受者的生存时间,增加Ⅰ型细胞因子IFN-γ和IL-2的分泌,提高淋巴细胞亚群CD8+T和NK细胞的增殖。经照射半相合DLI和CTX联合应用后,可以提高抗肿瘤疗效;将供者细胞T细胞删除后,可以降低抗肿瘤疗效。此外,多次的输注可提高抗肿效应,且输注治疗后均无GvHD产生。结论:经照射的半相合DLI可诱发HvT的作用,抑制荷瘤小鼠肿瘤生长;供者T细胞在输注诱发抗肿瘤的作用中扮演了重要角色;化疗预处理可以增强输注诱发的抗肿瘤作用;经照射的半相合DLI是一种安全有效的抗肿瘤方法。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 CB6F1 小鼠荷瘤模型的建立及照射对供者鼠淋巴细 胞的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 照射的半相合淋巴细胞的GvT 作用研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 照射的半相合淋巴细胞输注的抗肿瘤作用及机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 综述：肿瘤免疫研究进展
• 参考文献