彗星试验方法研究和在医药安全评价上的应用

论文摘要

彗星试验（Comet assay）又称单细胞凝胶电泳试验（SCGE）,是一种用于测定、研究单个细胞DNA断裂的新电泳技术。由于其具有简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记等特点,有极高的使用价值。其用于检测遗传毒性的敏感性与Ames试验相当,因此应用前景十分广泛。本文在建立该方法的基础上,将此方法扩展应用到医药安全性评价中。本研究依据Tice等（2000年）建立的国际性试验指导原则,采用医药人参皂苷Rg3冻干粉针为受试物,设3个试验剂量组,分别为140、70、35μg/ml、阴性对照组和以甲基磺酸甲酯（MMS）为阳性对照物的2个阳性对照剂量组,分别为1.1×10-3、11×10-3μg/ml,处理CHL细胞2h后,对CHL细胞进行单细胞凝胶电泳试验。从细胞的彗星图和试验数据分析可以看出,阴性对照组和人参皂苷Rg3冻干粉针各试验剂量组的受试细胞DNA均无明显损伤。阳性对照组细胞出现明显彗星,并随着MMS浓度的增大,彗星尾长明显增长,说明MMS浓度越高,对CHL细胞DNA的损伤越严重,且不同浓度MMS与CHL细胞的DNA损伤之间存在着明显的剂量效应关系且有可重复性。结果表明人参皂苷Rg3冻干粉针对CHL细胞DNA无明显损伤作用。且利用此方法检测人参皂苷Rg3冻干粉针无明显遗传毒性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 文献综述
• 1. 彗星试验的研究进展
• 1.1 彗星试验的发展史
• 1.2 彗星试验的试验方法
• 2. 彗星试验的应用
• 2.1 遗传毒理学研究
• 2.2 职业环境监测
• 2.3 环境生态监测
• 2.4 彗星试验在农药遗传毒性研究中的应用
• 2.5 医学诊断和药物治疗中的应用
• 3 彗星试验技术展望
• 正文
• 4. 材料与方法
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验对象——CHL 细胞
• 4.1.2 受试物——人参皂苷 Rg3 冻干粉针
• 4.1.3 阳性对照物质—甲基磺酸甲脂（MMS）
• 4.1.4 相关试剂
• 4.1.5 相关仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 细胞培养
• 4.2.2 试剂配制
• 4.2.3 凝胶制片
• 4.2.4 各层胶面琼脂糖用量的选择
• 4.2.5 琼脂糖浓度的选择
• 4.2.6 剂量设计
• 4.2.7 染毒
• 4.2.8 细胞生存率的测定
• 4.2.9 细胞溶解
• 13）DNA 解旋'>4.2.10 强碱性（pH>13）DNA 解旋
• 4.2.11 电泳
• 4.2.12 中和
• 4.2.13 染色
• 4.2.14 SCGE 检测不同浓度受试物和阳性对照物对CHL 细胞的作用
• 4.2.15 镜检与数据处理
• 5. 结果与分析
• 5.1 不同胶面琼脂糖溶液用量的选择
• 5.2 琼脂糖溶液浓度的选择
• 5.3 玻片的选择
• 5.4 制胶板
• 5.5 制胶环境温度
• 5.6 制片凝胶体的最佳条件
• 5.7 两种不同染毒方式的比较
• 5.8 染毒前、后细胞存活率测定结果
• 5.9 细胞裂解
• 5.10 DNA 解旋
• 5.11 DNA 电泳
• 5.12 不同浓度受试物作用于CHL 细胞彗星电泳图像
• 5.13 不同浓度阳性对照物MMS 对CHL 细胞DNA 损伤的彗星图
• 5.14 不同浓度阳性对照物MMS 对CHL 细胞DNA 迁移的效应
• 6. 讨论
• 6.1 彗星试验方法
• 6.1.1 凝胶制片
• 6.1.2 细胞溶解
• 13）DNA 解旋'>6.1.3 强碱性（pH>13）DNA 解旋
• 6.1.4 电泳
• 6.1.5 染色
• 6.1.6 镜检
• 6.2 体外染毒
• 6.3 彗星主要计算指标
• 6.3.1 形状指标
• 6.3.2 距离指标
• 6.3.3 强度指标
• 6.3.4 “矩”类指标
• 6.4 彗星试验的应用前景
• 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢
• 作者简历