（广州医科大学药学院广东广州511436）
【摘要】采用电喷雾离子源液质联用系统，葛根素和内标的选择性离子对分别为m/z417/399和m/z463/301。色谱柱为ZORBAXEclipsePlusC18（1.8μm，2.1×50mm）；流动相0.01%冰醋酸溶液:甲醇=20%:80%，流速0.3mL/min。最终线性范围为0.01～1000ng/mL。最低检测限为0.01ng/mL。该法成功用于静脉注射葛根素后，大鼠药动学研究。结论：该方法灵命度高，准确度高，可用于葛根素的定量研究。
【关键词】葛根素；LC-MS/MS;蛋白沉降
【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）15-0380-02
前言
葛根素在临床上常用于高血压、冠心病和心血管疾病的治疗。目前对这类异黄酮化合物的临床新应用及新机制探讨是研究热点[1,2]。然而，这类化合物的生物利用度很低[3]，因此在血浆或者细胞中药物浓度也很低，检测难度较大。
本研究开发了一个快速LC-MS/MS方法对血浆中的葛根素进行定量。分析时间为4min，定量下限可达到0.01ng/mL。该法的开发和应用为葛根素的深入研究提供了方法基础。
1.实验部分
1.1仪器与试剂
1260液相色谱分离系统，6460三重四级杆质谱联用系统，MassHunter工作站（美国安捷伦科技公司）。葛根素和鸢尾苷对照品购自美国Sigma公司。甲酸、乙腈、冰醋酸均为色谱纯，购自美国Fisher公司。
1.2LC-MS/MS方法
分析柱为安捷伦ZORBAXEclipsePlusC18（1.8μm，2.1×50mm）；流动相为0.01%冰醋酸溶液:甲醇=20%:80%，流速0.3mL/min。质谱为ESI离子源，正模式。血浆中葛根素含量通过多反应检测（MultipleReactionMonitoring,MRM）模式进行测定。葛根素选择离子对为m/z417/399，内标鸢尾苷离子对为m/z463/301。
1.3样品预处理
葛根素以200μg/mL溶解于水，并稀至系列浓度，大鼠混合空白血浆样品200μL中加入10μL系列浓度标准品，以及10μL内标溶液。涡旋5min后，加入400μL甲醇溶液，涡旋5min，13000rpm离心10min。分离有机相。标曲样品终浓度为0.01,0.1,1,10,1000ng/mL。质控样品（QC）终浓度为0.1，1，10ng/mL。
1.4方法验证
方法验证参考中国药典9012指导原则。主要验证参数为：专属性，回收率，线性，准确度，精密度，携带效应，基质效应及稳定性。
1.5动物实验
SPF级Sprague-Dawley大鼠，250g左右，雌雄各半。尾静脉注射葛根素的生理盐水溶液。注射剂量为20mg/kg。给药后1，2，4，6h尾静脉取血0.3mL。取血后于13000rpm离心15min，取上清，贮存于-80℃。
2.结果与讨论
2.1方法验证
血浆样品中的葛根素和内标没有收到内源性杂质的干扰。（见图）内标和维拉帕米的保留时间分别为1.8min和2.1min。
该方法的线性范围为0.01～4000ng/mL。批内和批间准确度均在85%～115%范围内，批内和批间精密度均在15%以内。说明该方法稳定可靠。
对基质对葛根素抑制约12%，对内标响应的抑制约为10%。
2.2方法应用：静脉注射维拉帕米后大鼠药动学研究
以上验证方法成功应用与静脉注射葛根素后大鼠药动学研究。静脉注射葛根素（20mg/kg）后，1h血药浓度为11.5±0.7μg/mL。
3.结论
本研究建立了血浆中葛根素的LC-MS/MS检测方法。该LC-MS/MS方法快速、稳定和灵敏。能够达到0.01ng/mL的最低检测限。3min之内能够完成一个样品测定。该验证方法成功应用于静脉注射葛根素后，大鼠药动学研究。这说名该方法适用于生物样品中葛根素的含量测定，为葛根素的临床研究提供了基础。
【参考文献】
[1]张玲,王洪新,齐志敏,孙媛.葛根素对大鼠心肌肥厚的相关细胞因子的影响.中成药,2007,29(7):960-963.
[2]陈蓉,谢梅林.葛根素对异丙肾上腺素诱导小鼠心肌纤维化的保护作用.华西药学志,2012,27(2):138-140.
[3]ChengfengLuo,MuYuan,MinshengChen.Metabolitesofpuerarinidentifiedbyliquidchromatographytandemmassspectrometry:Similarmetabolicprofilesinliverandintestineofrats.JounarlofChromatographyB,2010,878,363-370.