Zfy基因干扰对小鼠性别控制的研究

论文摘要

睾丸是雄性最重要的生殖腺,它是雄性激素分泌及精子发生的场所。Zfy基因位于Y染色体的短臂上,与精子的形成与发生相关,作为一个较强的转录激活因子,引导靶基因穿过核膜,定位于精子细胞核内,可能对精子变态过程中的某些基因具有转录激活作用。本研究根据Zfy基因特点,设计shRNA片段,进行Zfy基因的RNAi实验,采用RT-PCR分析干扰后Zfy基因的mRNA表达水平,并统计经干扰后子二代的性别比例。具体研究结果如下：1.根据Gen Bank提供的小鼠Zfy基因mRNA序列,针对该基因的编码区,设计并合成了shRNA干扰片段。以Ambion公司pSilencer5.1-H1 Retro为载体,构建小鼠靶向Zfy基因的shRNA表达载体pSilencer5.1/Zfy215及pSilencer5.1/Zfy2102,经酶切和序列测定证实,实验所构建的表达载体中含有设计合成的干扰序列,且插入序列的位置及方向均正确,上下游表达调控元件完整。说明两个shRNA表达载体构建成功,可以用于小鼠Zfy基因干扰实验。2.将构建的两个Zfy基因siRNA重组表达载体进行小鼠体内RNAi的研究。选取64只雄鼠随机分成四组（每组16只）,第一组、第二组为试验组,分别注射重组质粒p215与p2102,第三组与第四组作为对照组,分别注射同等体积的空载体pSilencer5.1-H1 Retro及生理盐水。间隔10天注射一次,连续注射4次。最后一次注射17d后,每组8只雄鼠按1：1与雌鼠交配,另外8只采集睾丸组织,利用荧光实时定量PCR法检测Zfy基因：mRNA的表达水平。结果表明,pSilencer5.1/Zfy2102干扰后Zfy基因的mRNA表达水平与对照组差异极显著（P<0.01）。繁殖试验表明后代雌鼠率达到72.3%,极显著高于对照组（P<0.01）。pSilencer5.1/Zfy215干扰后,Zfy基因的mRNA表达水平与对照组差异显著（P<0.05）,后代雌鼠率与对照组无显著差异。本文通过沉默生精过程中Zfy基因的表达,影响了Y精子的形成。值得指出的是,试验组与对照组子鼠数量及体重无显著差异,这可能表明沉默Zfy基因对早期胚胎发育没有影响。同时,将子一代的雌鼠与雄鼠饲养至性成熟并进行交配,子二代鼠的数量及体重与未进行任何处理的后代鼠间均无显著差异,说明干扰Zfy基因所产生的精子受精后不影响后代子的繁殖性能。通过干扰Zfy的表达成功实现了对小鼠进行受精前的性别控制,同时也为在其他动物的受精前的性别控制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• RNA干扰的原理、机制及在动物繁殖中的应用
• 1. RNAi的研究历史
• 2. RNAi的作用机理
• 3. siRNAs的常见制备
• 4. siRNA的介导途径
• 5. siRNA的体内导入途径
• 6. 检测RNAi结果的方法
• 7. RNAi的生物学意义
• 8. RNAi技术在动物繁殖中的应用
• 9. 展望
• 试验研究
• 实验一 小鼠Zfy基因shRNA表达载体的构建
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 靶序列的选择
• 2.2 表达载体的克隆与酶切鉴定
• 2.3 重组表达质粒的测序鉴定
• 3. 讨论
• 3.1 RNAi的作用机制
• 3.2 siRNA的设计原则
• 3.3 重组质粒的鉴定
• 实验二 Zfy基因shRNA表达载体的体内RNA干扰试验
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 实验动物
• 1.4 Zfy基因RNAi重组载体构建
• 1.5 重组质粒的大量制备与纯化
• 1.6 Zfy基因体内RNAi试验
• 1.7 qRT-PCR测定睾丸Zfy mRNA表达水平
• 1.8 数据统计
• 2. 结果与分析
• 2.1 PCR扩增结果
• 2.2 Zfy mRNA的表达水平
• 2.3 后代的性别比例
• 3. 讨论
• 参考文献
• 结论
• 创新点
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表