刺梨高含量AsA的积累机制及其关键酶基因的克隆与表达

论文题目: 刺梨高含量AsA的积累机制及其关键酶基因的克隆与表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 果树学

作者: 安华明

导师: 陈力耕

关键词: 刺梨,维生素,果实,叶片,积累特点,生物合成途径,半乳糖内酯脱氢酶,基因克隆,基因表达,半定量,抗氧化,植物表达载体,原核表达,遗传转化

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 刺梨（Rosa roxburghii Tratt）属蔷薇科蔷薇属植物,是原产我国的一种新兴果树。其果实肉脆、甜酸并具浓郁的特殊香味,特别是因为富含维生素C（AsA）而倍受世人关注,素有“维生素C之王”的美誉。也正因如此,近年来刺梨人工栽培规模日益扩大,有关刺梨果实的开发利用也卓有成效,在我国部分地区特别是西南地区的经济开发和生态建设中已经并正在发挥着非常重要的作用。但是,与此不相适应的是,对刺梨特别是刺梨果实合成和积累高水平AsA的相关科研工作几乎还未有涉及。 为此,本论文就刺梨果实合成和积累高水平AsA的生理原因、尘化途径,以及关键酶基因的分子克隆、时空表达、功能分析及遗传转化等方面进行了深入研究,以期为揭示刺梨这种特殊而珍贵的果树资源积累高含量AsA的生理机制和分子机理奠定理论基础,并可在此基础上为通过基因工程的方法提高农作物产品中AsA水平提供物质条件,取得的主要结果以下: 1 刺梨果实和叶片发育过程中具有不同的AsA积累特点 研究发现刺梨果实和叶片具有不同的AsA积累规律和特点:1) 积累量差异大:成熟刺梨果实中AsA含量约为1200 mg·100g-1FW,是常见高AsA水果或蔬菜的10～20倍以上;而刺梨叶内AsA含量约为174 mg·100g-1FW,只有果实的约七分之一。2) 积累模式不同:AsA在刺梨果实的整个发育过程中呈“慢一快一慢”的持续积累模式,即在最初40 d内AsA极少积累,并主要以氧化型（DHA）形式存在;6月中旬AsA开始逐渐积累,从6月底至8月初的约40 d内是刺梨果实AsA积累量最多和最重要的积累时期,期间的净积累量已达终积累量的约90%;之后随着果实逐渐成熟,AsA几乎停止积累。而就叶片而言,在未完全展开的幼叶中含有比其他叶龄叶片更高的还原型AsA含量,并且随着叶龄的增加稍许降低,衰老叶内不含AsA;完全展开叶内含有最高的AsA库（AsA+DHA）,但其中大部分为氧化型（DHA）。3) 所含AsA型态占AsA库的比例不同:果实中主要为还原态AsA,DHA含量还不足总AsA量的0.2‰;而叶内DHA所占比例较大,至少30%以上,在完全展开叶中甚至高达67%。 2 刺梨Gal LDH的基本生化特性及其在果实发育过程中的活性变化与AsA积累的关系 蛋白质结构和活性分析表明,与其他植物一样,刺梨Gal LDH也定位于线粒体。浓度为1 mmol/L的CuSO4和ZnSO4等二价会属盐能抑制刺梨Gal LDH约30%的酶活性,有机抑制剂丫啶黄素（Acriflavine）的抑制作用最强,能抑制其约70%的酶活性,而早期报道的Gal LDH酶强抑制剂石蒜碱（Lycorine）即使处理浓度达340 μmol/L时对刺梨Gal LDH酶活性也几乎没有作用;此外,以D-葡萄糖醛酸作为反应底物时刺梨Gal LDH能表现约40%的活性。刺梨果实发育过程中Gal LDH酶活性变化与AsA

论文目录:

缩略语表

中文摘要

ABSTRACT

第一章 前人研究进展与本课题立论依据

一、前人研究进展

1 维生素C的发现、化学结构以及对人类的意义

2 高等植物中AsA的功能、合成、运输和代谢研究进展

2.1 高等植物中AsA的生理功能

2.1.1 AsA在植物体的抗氧化系统中起着重要的作用

2.1.2 AsA在光合作用和光合保护中起重要作用

2.1.3 AsA在细胞壁代谢和细胞膨大中的作用

2.1.4 AsA对细胞分裂的影响

2.1.5 AsA可作为一系列重要酶反应的辅因子(Cofactor)

2.1.6 AsA在植物信号传递过程中起重要作用

2.2 高等植物中AsA的合成途径

2.2.1 碳链倒位途径

2.2.2 邻酮醛糖途径

2.2.3 L-半乳糖途径

2.2.4 可能的交替途径：糖醛酸转变途径

2.3 AsA在植物细胞内的运输和代谢

2.3.1 植物细胞内AsA的跨膜运输

2.3.2 AsA在植物细胞内的氧化还原过程

2.3.3 植物体内AsA的分解

2.4 影响AsA积累的因素及调控措施

2.4.1 影响AsA积累的因素

2.4.2 调控措施

3 调控高等植物AsA合成及代谢循环的相关酶研究进展

3.1 AsA合成相关酶

3.2 AsA代谢循环酶

4 果树合成和积累AsA的研究进展

4.1 果树合成和积累AsA的相关研究进展

4.2 刺梨及刺梨积累高含量AsA的相关研究

二、立论依据及研究内容

3.1 立论依据与研究目的及意义

3.2 研究思路及主要研究内容

第二章 刺梨果实合成和积累高含量AsA的一般特点、生理机制及可能途径

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料

1.1.2 主要试剂

1.2 实验方法

1.2.1 果实鲜重及干重测定

1.2.2 水溶性总糖、还原糖及蔗糖含量的测定

1.2.3 前体物喂饲(precursor feeding)

1.2.4 AsA和DHA含量的测定

1.2.5 半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)活性测定

1.2.6 不同底物和不同抑制剂对GalLDH活性的影响

1.2.7 AAO、AAP以及MDAR、DHAR活性测定

2 结果与分析

2.1 刺梨果实的生长发育规律

2.2 刺梨果实发育过程中AsA的积累规律

2.3 刺梨果实发育过程中碳水化合物含量的变化

2.4 刺梨果实发育过程中GalLDH活性的变化及其与AsA积累的关系

2.5 不同底物和不同抑制剂对GalLDH活性的影响

2.6 刺梨果实发育过程中AAO、AAP以及MDAR、DHAR活性的变化

2.7 不同前体物在刺梨果实AsA合成中的效率及刺梨果实合成AsA的可能途径

3 讨论

第三章 刺梨叶积累AsA的一般特点及其衰老过程中AsA含量和部分抗氧化酶活性的变化

1 材料与方法

1.1 实验材料及取样方法

1.2 实验方法

1.2.1 叶片质膜透性测定

1.2.2 叶片色素测定

1.2.3 O_(2.)~-产生速率测定

1.2.4 POD、CAT、丙二醛(MDA)和可溶性蛋白质含量测定

1.2.5 AsA和脱氢抗坏血酸(DHA)含量测定

1.2.6 半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)活性测定

1.2.7 前体物喂饲(precursor feeding)

2 结果与分析

2.1 刺梨叶片积累AsA的一般特点

2.2 不同喂饲底物在刺梨叶片积累AsA中的效率

2.3 刺梨叶衰老过程中光合色素含量的变化

2.4 刺梨叶衰老过程中O_(2.)~-产生速率、MDA含量和细胞质膜透性的变化

2.5 刺梨叶衰老过程中AsA和DHA含量的变化

2.6 刺梨叶衰老过程中POD、CAT及可溶性蛋白质含量的变化

3 讨论

第四章 刺梨L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)基因的克隆与分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取及质量检测

1.2.2 RT-PCR

1.2.3 3′-和5′-快速扩增cDNA末端(RACE)

1.2.4 GalLDH基因全长cDNA序列的分离

1.2.5 特异带的回收、克隆和测序

1.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA的转化方法

1.2.7 质粒提取方法

1.2.8 刺梨基因组DNA提取

1.2.9 刺梨GalLDH基因的Southern blot分析

2 结果与分析

2.1 RNA质量

2.2 刺梨GalLDH基因的RT-PCR及RACE扩增

2.3 GalLDH基因全长cDNA序列的分离及验证

2.4 刺梨GalLDH基因全长cDNA及其氨基酸序列分析

2.5 不同植物GalLDH基因氨基酸序列比较分析

2.6 刺梨GalLDH基因的Southern blot分析

3 讨论

第五章 刺梨GalLDH基因在Escherichia coli中的表达

1 材料与方法

1.1 表达载体和试剂

1.2 实验方法

1.2.1 GalLDH原核表达载体构建

1.2.2 载体转化和诱导表达

1.2.3 SDS-PAGE检测

1.2.4 GalLDH活性测定

2 结果与分析

2.1 刺梨GalLDH原核表达载体的验证

2.2 刺梨GalLDH基因在E.coli中的表达

3 讨论

第六章 刺梨L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)基因的时空表达及其与AsA积累的关系

1 材料与方法

1.1 实验材料及取样方法

1.2 实验方法

1.2.1 刺梨RNA及基因组DNA提取

1.2.2 GalLDH的Northern blot分析

1.2.3 RT-PCR

1.2.4 GalLDH表达的半定量RT-PCR(Semiquantitative RT-PCR)分析

1.2.5 GalLDH酶活性测定

1.2.6 AsA和DHA含量测定

1.2.7 刺梨ACO基因的克隆及在果实中的表达分析

2 结果与分析

2.1 刺梨GalLDH在不同器官的表达及其与AsA积累的关系

2.2 GalLDH在刺梨果实不同发育时期的表达及其与AsA积累的关系

2.2.1 Northern blot分析

2.2.2 半定量RT-PCR分析

2.3 刺梨ACO基因的克隆、在果实中的表达及其与GalLDH表达的关系

2.3.1 刺梨ACO基因的克隆

2.3.2 刺梨ACO基因在果实发育过程中的表达及其与GalLDH表达的关系

3 讨论

第七章 刺梨L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)基因遗传转化草莓的初步研究

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料及繁殖

1.1.2 载体、农杆菌菌株及实验试剂

1.2 实验方法

1.2.1 表达载体构建

1.2.2 农杆菌感受态细胞制备与转化

1.2.3 草莓叶盘的预培养

1.2.4 草莓叶对潮霉素B的敏感性试验

1.2.5 草莓的遗传转化

2 结果与分析

2.1 刺梨GalLDH基因植物表达载体构建及验证

2.2 草莓叶对潮霉素的敏感性

2.3 刺梨GalLDH基因遗传转化草莓的初步研究

3 讨论

参考文献

在读期间发表论文情况

发布时间: 2005-07-22

参考文献

• [1].猕猴桃AsA合成相关酶基因及启动子的克隆与功能分析[D]. 李娟.西北农林科技大学2013
• [2].番茄Dof基因家族全基因组分析及SlDof22、SlDHAR1和FaGalUR在AsA积累中的功能分析[D]. 蔡晓锋.华中农业大学2014
• [3].调控番茄抗坏血酸合成的基因克隆与功能鉴定[D]. 胡体旭.华中农业大学2015

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