论文摘要
背景肺癌是危害人类健康的严重疾病,其发病率和死亡率在恶性肿瘤中位居首位,5年平均生存率仅有14%,75%的肺癌病人就诊时已是晚期,化疗是其主要治疗手段[1]。临床发现多药耐药（Multidrug resistance,MDR）是肺癌患者低生存率的主要原因之一,也是治疗中急需解决的难题。多药耐药是肿瘤细胞接触一种抗癌药物后导致对多种结构和作用机制不同的抗癌药物产生耐受性。在肺癌化疗中,顺铂（cis-dichlorodiamine platinum,CDDP）是有效并广泛应用的一线药物,但由于耐药问题的存在使其疗效不尽人意。国内外研究表明,肺癌细胞对化疗药物耐受的机制是一个多基因参与的复杂事件,虽然已经发现由跨膜转运蛋白如P-170（P-gp）糖蛋白、多药耐药相关蛋白和肺耐药相关蛋白介导的典型耐药途径;和由其它非跨膜机制如凋亡、酶活性、细胞内pH等变化介导的非典型耐药途径,但肺癌多药耐药的机制仍未完全阐明,而且不同的药物诱导肺癌MDR的机制亦不尽相同[2-4]。只有不断寻找新的耐药相关基因并进行深入研究,才有希望阐明肺癌MDR的机制进而逆转耐药。CA916798基因是采用抑制消减杂交（SSH）技术筛选肺腺癌MDR细胞系SPC-A-1/CDDP与其亲代细胞获得一条在耐药细胞中高表达的新基因,已登录于GenBank的EST库,收录号即为CA916798。经研究发现,CA916798基因在肺癌耐药细胞中的表达较其亲代细胞明显上调[5]。目前已经克隆了CA916798基因的全长cDNA并经测序加以证实[5],经序列同源性分析表明,它与已知的耐药相关基因无明显同源性。因此推测,它可能在顺铂诱导的多药耐药中起作用,对CA916798基因及其编码的蛋白进行深入研究对阐明顺铂耐药形成的分子机制及对顺铂耐药的逆转具有重要意义。目的了解CA916798基因在顺铂诱导的肺癌耐药细胞中的作用,明确该基因及其编码蛋白与肺癌MDR的关系,为进一步研究该基因的生物学功能以期寻找新的逆转耐药途径提供基础。方法1.构建CA916798基因蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化CA916798基因编码的蛋白。2.筛选并制备高滴度的抗CA916798多克隆抗体,采用荧光免疫细胞化学方法对该蛋白在细胞内的表达进行定位。3.采用基因转染、RNA干扰技术从正反两方面探讨高表达及沉默该基因表达对肺癌细胞生物学行为的影响,阐明其功能。结果1.克隆出CA916798基因开放阅读框序列,并成功构建原核表达重组质粒pET42a/CA916798。2.CA916798蛋白主要以不溶性的包涵体形式在大肠杆菌胞质中大量高效表达,表达产量满足抗体制备量的要求。3.CA916798融合蛋白免疫动物后,获得高滴度的抗CA916798多克隆抗体,产生的抗体可以识别BL21（pET42a/CA916798）表达的融合蛋白、人肺腺癌NCI-A549、A549/CDDP总蛋白,说明CA916798融合蛋白具有良好的免疫原性和抗原性,制备的抗体为后期CA916798功能研究打下基础。4.采用荧光免疫细胞化学方法对该蛋白在细胞内的表达进行定位,结果显示其主要在细胞浆内表达;在耐药细胞株A549/CDDP高表达,H446细胞中低表达（p<0.01）。5.本实验成功构建了CA916798基因真核表达载体,并将其转入人小细胞肺癌细胞株NCI-H446,建立了稳定高表达CA916798基因的人小细胞肺癌细胞系NCI-H446/CA916798。6.顺铂作用后,NCI-H446/CA916798细胞较空载体转染组细胞,生长增殖速度加快,细胞凋亡率下降（p<0.01）,对多种抗肿瘤药具有抗药性。7.成功构建四条能在细胞内表达小干扰RNA以特异降解CA916798 mRNA而导致CA916798基因沉默的重组质粒,并将其转染高表达CA916798基因的耐药细胞A549/CDDP,建立可稳定下调表达CA916798的A549/CDDP细胞株。8.稳定转染4条shRNA后,CA916798表达在mRNA水平和蛋白水平上均受到了抑制,其中pRNAi-CA3组对CA916798表达抑制率最强,对顺铂耐药的相对逆转率最高（p<0.01）。9.顺铂作用后,pRNAi/CA916798-A549/CDDP细胞较空载体转染组细胞,生长增殖速度降低,细胞凋亡率增加,主要被抑制在G2期。10.靶向干扰CA916798基因后,pRNAi-CA3-A549/CDDP细胞株对多种化疗药物耐药性减弱,敏感性增强（p<0.05）。结论1.构建了CA916798基因蛋白表达载体;CA916798融合蛋白主要以不溶性的包涵体形式在大肠杆菌胞质中大量高效表达,表达产量满足抗体制备量的要求,具有良好的免疫原性和抗原性;制备的抗CA916798多克隆抗体效价高;通过荧光免疫细胞化学方法证实该蛋白在细胞浆内的表达。2.成功构建该基因的真核表达载体,转染对顺铂敏感且本身CA916798基因表达量很低的小细胞肺癌细胞株NCI-H446,筛选出阳性细胞,建立了可稳定高表达CA916798的细胞株;NCI-H446/CA916798细胞能稳定表达CA916798基因,对多种抗肿瘤药具有抗药性,为下一步研究CA916798介导的多药耐药机理研究奠定了基础。3.成功构建CA916798 siRNAs真核表达质粒并建立了稳定下调表达该基因的细胞株pRNAi/CA916798-A549/CDDP。A549/CDDP细胞株在成功转染CA916798 shRNA后,从蛋白水平、mRNA表达水平,细胞水平与CDDP耐药逆转4个方面的数据与未干扰组比较,其中pRNAi-CA3组对耐药的相对逆转率最高,为下一步靶向干扰多药耐药基因逆转肺癌多药耐药奠定基础。4.采用基因转染、RNA干扰技术从正反两方面证实CA916798基因为新的肺癌多药耐药相关基因,该研究为克服肺癌化疗耐药提供了新的突破口。