拟南芥抗病基因在烟草中的遗传转化和表达分析

论文摘要

拟南芥是研究植物与病原生物的互作、剖析抗病信号通路的最重要的模式植物。分析表明,拟南芥基因组中编码NBS-LRR类抗病蛋白的基因共有198个,是植物中已知的最大的抗病基因家族；编码RLKs类蛋白的基因至少有610个,占其蛋白质编码基因总量的2.5%。这些基因在拟南芥的发育和抗病反应中发挥着重要的作用,但只有少数基因的功能被注释。本实验的目的是将9个编码NBS-LRR类和RLK类蛋白的R基因通过农杆菌介导的方法转化烟草品种Nicotiana benthamiana,研究这物种在转录和调控水平的亲和性,这对理解拟南芥和烟草这两种物种间的抗病信号通路的保守性有一定的参考价值,有助于探讨远源物种间R基因的利用。本论文主要的研究内容和结果如下：1.将9个拟南芥的抗病基因和类似抗病基因转化烟草N. benthamiana,分别经过NPTII和CATMA引物的PCR筛选,均已获得阳性转基因植株,转化率达到81.6%。2. Trizol法提取阳性植株的RNA,进行RT-PCR检测,结果表明,at5g43470（RPP8）和at5g46330（FLS2）这两个基因能在烟草中成功表达；at2g19190（FRK1）能被转录,但出现了剪接异常的现象,它在烟草N. benthamiana的转录片段明显小于在拟南芥中的转录片段；而转化的其它基因则未能检测到mRNA水平上的表达。本论文亚克隆的所有基因均完整包含其自身的启动子和终止子等调控元件,当整合进外源植物基因组后,其转录与翻译完全依赖受体植物的转录调控系统。at5g43470（RPP8）, at5g46530（FLS2）和at2g19190 （FRK1）的转录说明烟草和拟南芥这两个物种的转录因子和调控机制存在亲和性,但at2g9190 （FRK1）的剪切异常则表明两物种的亲和程度不同,而未能表达的基因可能是因为拟南芥基因的启动子不能被烟草的转录因子识别,这说明这两个亲缘关系十分疏远的物种的部分转录和调控因子的功能相对保守。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 文献综述
• 1 植物抗病机制
• 1.1 植物的抗病性的类型
• 1.2 植物的抗病机制
• 1.3 抗病基因（resistence gene,R基因）的类型及其编码的蛋白结构
• 1.4 病原菌的无毒基因
• 1.5 植物抗病基因与病原无毒基因的互作
• 2 拟南芥的抗病基因
• 2.1 RLK基因家族
• 2.2 NBS-LRR抗病基因家族
• 2.3 本实验研究的抗病基因的研究进展
• 3 R基因的利用存在的问题及发展趋势
• 4 论文的立题依据,研究目的,研究内容及意义
• 4.1 立题依据
• 4.1.1 不同科植物的基因组的共线性关系
• 4.1.2 拟南芥与茄科植物抗病信号通路中存在功能保守的基因
• 4.2 开展本研究的目的和意义
• 4.3 本实验的研究内容
• 第二章 拟南芥抗病基因转化烟草及其PCR验证
• 1 前言
• 2 材料
• 2.1 菌株和载体
• 2.2 植物材料
• 2.3 培养基
• 2.3.1 植物培养基
• 2.3.2 LB培养基
• 2.4 试剂
• 3 方法
• 3.1 用于转化的根癌农杆菌的准备
• 3.1.1 农杆菌C58C1的感受态的制备
• 3.1.2 电击转化农杆菌C58C1
• 3.2 烟草遗传转化体系的建立
• 3.2.1 烟草N.benthamiana无菌苗的获得
• 3.2.2 卡那霉素临界值的确定
• 3.2.3 菌株的活化
• 3.2.4 材料预培养
• 3.2.5 浸染
• 3.2.6 共培养
• 3.2.7 脱菌及选择培养
• 3.2.8 生根培养
• 3.2.9 组培苗的炼苗和移栽
• 3.3 转基因烟草的PCR鉴定
• 3.3.1 植物总DNA的提取
• 3.3.2 转基因烟草中nptⅡ基因和目的基因的PCR检测
• 4 结果与分析
• 4.1 卡那霉素临界值的筛选结果
• 4.2 转基因烟草再生苗的获得
• 4.3 烟草转化抗性植株的PCR检测结果
• 4.3.1 转基因植株基因组DNA的提取
• 4.3.2 nptⅡ基因的检测结果
• 4.3.3 目的基因CAMTA引物的扩增结果
• 5 讨论
• 5.1 卡那霉素作用的原理
• 5.2 菌液浓度和侵染时间对转化效率的影响
• 5.3 预培养对烟草遗传转化的影响
• 5.4 特异重组位点及特异信号序列的应用
• 5.5 引物NPTⅡ可以用来快速鉴定筛选转基因植株
• 6 结论
• 第三章 转基因烟草的表达分析
• 1 前言
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 3.1 烟草叶片总RNA的提取
• 3.2 跨内含子引物的设计
• 3.3 转基因烟草的RT-PCR检测
• 4 结果和分析
• 4.1 提取RNA的质量检测
• 4.2 转基因植株的RNA提取和转基因苗中R基因转录水平上表达的RT-PCR检测
• 5 讨论
• 5.1 跨内含子引物的设计
• 5.2 部分拟南芥抗病基因能在其远缘物种烟草中表达
• 6 结论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历