黄色粘球菌DK1622基因组岛的必需性分析及其在细胞群体行为中的作用研究

论文摘要

粘细菌是一类具有复杂多细胞社会学行为的革兰氏阴性单细胞滑动细菌,能够合成多种抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、免疫调节等生物活性的天然产物。黄色粘球菌(Myxococcus xanthus, M. xanthus) DK1622是研究粘细菌多细胞群体行为及遗传与进化的陆生模式菌株,属于孢囊杆菌亚目的粘球菌属,不含内源性质粒,染色体为一条环状双链DNA,基因组序列全长为9.14Mb左右,其多细胞群体行为主要表现为双运动系统支配的滑行运动、子实体发育及粘孢子形成、自然环境中的群体捕食行为等。纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)属于堆囊菌亚目的堆囊菌属,具有迄今为止发表的最大的原核生物基因组,是粘细菌中次级代谢产物数量最多、种类最为丰富的一个菌种,合成的次级代谢产物几乎占所有已发现粘细菌种类的一半,并且几乎100%的菌株都具有合成生物学活性物质的能力。埃博霉素(epothilone)即是纤维堆囊菌产生的一类大环内酯类聚酮化合物,具有促微管聚合活性,是继紫杉醇之后发现的作用于微管的抗肿瘤化合物中最令人兴奋的研究热点之一,是极具潜力的抗癌药物。但是由于代时长(16h)、遗传操作体系不成熟及遗传背景不清晰等限制因素,纤维堆囊菌的研究远远落后于其它药源微生物,埃博霉素的生物发酵也难以工业化生产,因此异源表达可能成为一种提高埃博霉素发酵产量的有效途径。而作为异源表达的合适的“底盘”细胞,应具有精简、健壮的基因组结构,即“最小”基因组,从而最大程度的降低噪声干扰,提高对所设计系统的可控性和可操作性。本课题研究目的是为了寻找黄色粘球菌DK1622基因组水平转移获得的非必需基因簇,首先对DK1622基因组岛进行生物信息学预测和必需性分析,并进行大规模失活实验以确定基因组岛片段的必需性,以期为粘细菌“最小”基因组研究奠定基础。本论文首先采用IslandPath预测了DK1622基因组19个片段可能为水平转移的基因组岛(GIs),总长度接近400kb,约占基因组仝长的4.5%左右：接着从基因注释、蛋白比对、代谢途径预测以及基因表达分析等方面对预测的19个GIs进行了基因必需性分析。分析结果显示,GIs一半多基因编码未知功能的假定蛋白,不参与DK1622的基本初级代谢途径,发挥的生物学功能尚不清晰,因此,我们初步推测GIs是DK1622的非必需基因,但是表达分析显示部分基因在粘细菌生长阶段和发育阶段能够表达；为了进一步确定GIs在DK1622维持正常生命活动中的必需性,我们借助自杀性质粒的同源重组进行GI失活实验,实验获得了12株GI敲除突变株,生长能力分析结果显示12个GI不能影响DK1622正常生命活动,是DK1622的非必需基因,因此可以进行大规模基因组片段剔除来精简基因组。本部分实验结果为我们下一步的“最小”基因组研究和“底盘”细胞的构建提供了依据和基础。同时,为了研究GIs在粘细菌社会学行为中发挥的作用,我们对12株GI缺失突变株的多细胞群体行为表征进行了分析。结果显示,GIs的敲除对粘细菌DK1622的双运动系统、捕食能力影响不大,GI01和G103在粘细菌的子实体发育及孢子产生方面发挥着一定作用,这将有助于我们更好地理解粘细菌的进化适应问题。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明及缩写词
• 第一章 文献综述
• 1.1 粘细菌简介
• 1.1.1 粘细菌的基本特征及分类地位
• 1.1.2 粘细菌社会学行为特征
• 1.1.2.1 双运动系统支配的菌株滑行运动
• 1.1.2.2 子实体的发育及抗逆性粘孢子的形成
• 1.1.2.3 自然环境下的群体捕食行为
• 1.1.3 粘细菌次级代谢产物
• 1.1.3.1 粘细菌次级代谢产物种类及特点
• 1.1.3.2 纤维堆囊菌及其次级代谢产物研究
• 1.2 海洋耐盐橙色粘球菌HW-1研究进展
• 1.2.1 海洋耐盐粘细菌特殊的海洋环境适应模式
• 1.2.2 HW-1环境适应分子机制研究进展
• 1.3 基因组最小化研究进展
• 1.3.1 合成生物学简介
• 1.3.2 基因组最小化
• 1.3.3 基因组岛研究进展
• 1.3.3.1 基因组岛的定义及生物学功能
• 1.3.3.2 基因组岛的特征及预测方法
• 1.4 本论文开展思路和研究内容
• 第二章 粘球菌DK1622基因组岛预测与基因必需性分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 粘球菌基因组信息
• 2.1.2 生物信息数据库及分析软件
• 2.1.3 菌株及质粒
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 试剂和仪器耗材
• 2.2 室验方法
• 2.2.1 DK1622基因组岛预测分析方法
• 2.2.2 基因组测序和比较基因组方法
• 2.2.3 报告基因融合表达载体构建方法
• 2.2.3.1 引物的设计及合成
• 2.2.3.2 同源臂片段的扩增及纯化
• 2.2.3.3 同源臂片段与质粒的连接及转化
• 2.2.4 表达载体电转化及突变株的筛选
• 2.2.5 X-gal底物平板显色实验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 DK1622的基因组岛预测结果
• 2.3.2 M.xanthusDK1622和M.fulvusHW-1比较基因组
• 2.3.3 基因组岛的表达分析结果
• 2.3.3.1 报告基因融合表达载体构建
• 2.3.3.2 表达载体的电转化及突变株筛选
• 2.3.3.3 表达菌株的X-gal底物平板检测
• 2.4 本章小结
• 第三章 基因组岛的敲除及突变株的表型特征分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株及质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 实验试剂
• 3.2 室验方法
• 3.2.1 基因组岛敲除载体的构建
• 3.2.1.1 引物的设计及合成
• 3.2.1.2 同源臂的扩增及连接
• 3.2.1.3 同源臂片段和质粒的预处理
• 3.2.1.4 质粒和同源臂的连接及转化
• 3.2.2 敲除载体电转化野生株DK1622
• 3.2.3 基因组岛敲除突变株的筛选及纯化
• 3.2.4 基因组岛敲除突变株的表型特征分析
• 3.2.4.1 生长能力分析
• 3.2.4.2 子实体发育及生孢能力分析
• 3.2.4.3 菌落边缘观察及运动能力分析
• 3.2.4.4 捕食能力分析
• 3.3 实验结果与分析
• 3.3.1 基因组岛敲除载体的构建及验证
• 3.3.2 基因组岛敲除突变株的筛选及纯化
• 3.3.3 基因组岛敲除突变株的表型特征分析
• 3.3.3.1 生长能力的分析
• 3.3.3.2 菌落边缘及运动能力分析
• 3.3.3.3 子实体发育及粘孢子形成能力的分析
• 3.3.3.4 捕食能力的分析
• 3.4 本章小结
• 总结与展望
• 附录1 论文涉及的引物信息
• 附录1.1 报告基因融合表达载体构建所需引物信息
• 附录1.2 基因组岛定点敲除载体构建所需引物信息
• 附录2 论文相关的质粒信息
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 附件