论文摘要
蛋白激酶是细胞内一类最重要的功能蛋白,在细胞信号通路中发挥着重要的作用。酪氨酸蛋白激酶（PTKs）是重要的蛋白激酶,其介导或者参与的细胞内信号通路在调节细胞增殖、分泌、分化和凋亡过程中占重要地位。其功能的失调与恶性肿瘤、免疫疾患、动脉粥样硬化、糖尿病等多种疾病的发生密切相关。PTKs抑制剂可有效调节PTKs活性,治疗PTKs参与的“细胞信号紊乱”相关疾病。研发活性高、选择性强的新型PTKs抑制剂具有重要意义。巨噬细胞集落刺激因子受体激酶（c-Fms）,是由原癌基因c-fms编码的一种受体酪氨酸激酶,与血小板衍生生长因子α、β受体（PDGFRα,β）、干细胞生长因子受体（SCFR/c-Kit）、FMS样酪氨酸激酶3（FLT-3）等同属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族。c-Fms与其配体巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）结合后,形成二聚体,进而表现出酪氨酸激酶的催化活性,激活c-Fms介导的胞内信号转导途径,促进单核巨噬细胞系的存活、增殖和分化。c-fms基因序列缺失、重复复制、突变、染色体易位等因素导致c-Fms的激酶活性异常增强,与骨髓增生异常综合征（MDS）、急性髓系白血病（AML）、急性巨核细胞白血病（AMKL）、动脉粥样硬化、乳腺癌、子宫颈癌、类风湿性关节炎等疾病密切相关。鉴于c-Fms独特的生物学作用与病理生理学特点,研发靶向该受体激酶的抑制剂可能发现新的靶向治疗药物。目前处于临床前研究阶段发展较好的c-Fms抑制剂有GW2580、Ki20227和JNJ-28312141,它们可有效抑制c-Fms激酶的磷酸化,改善小鼠肿瘤细胞转移引起的骨质溶解和糜烂;JNJ-28312141还可抑制大鼠移植肿瘤细胞的生长。因此,新型c-Fms抑制剂的发现是目前国际新药研发的一个重点和热点。鉴于高效筛选模型是新药发现的关键和核心的环节。因此,确定本课题研究的目的是:（1）建立c-Fms抑制剂的高效筛选模型和方法;（2）进行筛选化合物,以期发现活性强的新型c-Fms抑制剂。本研究工作由两部分组成:第一部分,c-Fms抑制剂筛选模型的建立,包括两个方面:（1）基于高内涵分析技术c-Fms抑制剂筛选模型的建立;（2）基于激酶盘不依赖M-CSF的c-Fms抑制剂细胞水平筛选模型的建立。第二部分,利用M-CSF依赖的细胞株和所建立的基于高内涵分析技术的c-Fms激酶抑制剂筛选模型进行化合物的筛选。第一部分,c-Fms抑制剂筛选模型的建立。基于高内涵分析技术c-Fms抑制剂筛选模型的建立:采用分子克隆和细胞转染技术,将构建的含有人c-Fms cDNA全长序列的真核表达载体,转染已稳定表达GFP-STAT1融合蛋白的人骨肉瘤细胞（U2OS）,采用有限稀释法和小玻片培养法获得同时稳定表达人c-Fms和GFP-STAT1融合蛋白的单克隆细胞株（c-Fms/GFP-STAT1U2OS）。以重组人巨噬细胞集落刺激因子（rhM-CSF）处理该细胞,诱导GFP-STAT1核转位,采用高内涵分析系统获取细胞图像,并用细胞核转位分析模块（Nuclear Trafficking Analysis Module）定量分析GFP-STAT1的核转位程度。在该细胞模型上对rhM-CSF的有效浓度、处理时间和细胞接种密度等实验条件进行优化,通过Z′因子评估该细胞模型的可靠性,并采用已知的c-Fms抑制剂GW2580等进一步确证模型的有效性。结果表明,实验中细胞接种密度0.21.0×104个/孔,rhM-CSF处理细胞的时间在30min较为适宜;rhM-CSF诱发细胞内GFP-STAT1发生核转位的EC50为43.50±3.68 ng/mL;rhM-CSF终浓度为200ng/mL时,Z′因子值为0.618。c-Fms选择性抑制剂GW2580抑制GFP-STAT1核转位的IC50为24.86±1.50nM,完全抑制c-Fms介导GFP-STAT1核转位的浓度为0.3μM。多靶标的受体酪氨酸激酶抑制剂Sutent抑制GFP-STAT1核转位的IC50为14.85±0.55nM;Imatinib抑制GFP-STAT1发生核转位的IC50为196.14±21.69nM。综上表明,本研究成功建立了能够用于c-Fms抑制剂筛选的基于高内涵分析的新细胞模型。基于激酶盘不依赖M-CSF的c-Fms抑制剂细胞水平筛选模型的建立:采用DNA重组技术,将人的c-Src豆蔻酰化多肽、TEL（Translocation E26 transforming-specific Leukaemia）转录因子的螺旋-环-螺旋结构域（HLH domain）、人c-Fms激酶结构域（c-Fms kinase domain,cFmskd）以及c-Myc多肽标签的DNA序列克隆到pCORON/neo载体上,构建pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc激酶盘真核表达载体。通过脂质体转染方法将该载体分别转染已稳定表达GFP-STAT1融合蛋白的人骨肉瘤细胞和稳定表达EGFP-STAT3融合蛋白的幼仓鼠肾细胞（EGFP-STAT3BHK）,在细胞中表达mTEL-cFmskd豆蔻酰化融合蛋白,诱导GFP-STAT1或EGFP-STAT3发生核转位。采用IN Cell Analyzer1000获取细胞图像,并以细胞核转位分析模块定量分析GFP-STAT1和EGFP-STAT3融合蛋白的核转位程度。用0.03μM、0.3μM的c-Fms抑制剂GW2580、Sutent和Imatinib分别处理转染激酶盘真核表达载体12h后的EGFP-STAT3BHK细胞,考察c-Fms抑制剂对表达的mTEL-cFmskd豆蔻酰化融合蛋白诱导EGFP-STAT3发生核转位的影响。结果,成功构建的pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc激酶盘真核表达载体转染细胞24h后,可在U2OS或BHK细胞中有效诱导GFP-STAT1或EGFP-STAT3发生核转位现象。在黑色底透96孔培养板中,100、200、400、600和800ng/孔的载体转染BHK细胞,对细胞内EGFP-STAT3的核转位程度无明显影响,所对应的Z′因子值分别为0.600、0.701、0.574、0.812和0.637。0.3μM的c-Fms抑制剂GW2580（P<0.05）和Sutent（P<0.01）能有效抑制mTEL-cFmskd诱导EGFP-STAT3核转位,也进一步证实该筛选模型的可行性。以上结果表明该体系可作为c-Fms抑制剂筛选的新方法。第二部分,利用M-CSF依赖的小鼠骨髓性白血病细胞（M-NFS-60）和基于高内涵分析技术的依赖M-CSF的c-Fms抑制剂筛选模型,对靶向c-Fms设计及合成的34个新化合物进行活性筛选。在M-NFS-60细胞模型上,有10个化合物对M-NFS-60细胞的增殖具有较好的抑制活性,其中化合物LK-A051、LK-B030和LK-B023的I C50分别为0.64±0.03μM、0.63±0.02μM和1.41±0.20μM。在c-Fms/GFP-STAT1U2OS细胞模型上,阳性化合物GW2580抑制c-Fms介导的GFP-STAT1核转位的IC50为24.86±1.50nM。在已筛选的新化合物中,LK-A051和LK-B023对GFP-STAT1核转位具有较好的抑制活性,其IC50分别为3.88±0.49nM和1.62±0.04μM。化合物LK-A051的活性明显高于三个已知c-Fms抑制剂。综上所述,本课题主要结论如下:1)基于c-Fms介导的细胞内信号转导通路,成功建立基于高内涵分析技术依赖rhM-CSF的c-Fms抑制剂筛选模型。已知的c-Fms抑制剂GW2580、Sutent和Imatinib在该模型上的抑制活性是文献已报道其他细胞模型的3～10倍。因此,与其他模型相比,该模型具有灵敏、高效等优点。2)成功构建以人c-Fms为代表的pCORON/neo-HcSrc-Tel-cfmskd-Myc激酶盘真核表达载体。该载体在GFP-STAT1U2OS和EGFP-STAT3BHK细胞中表达能有效诱导胞内GFP-STAT1和EGFP-STAT3发生核转位。100～800ng/孔的载体转染细胞诱导EGFP-STAT3发生核转位的Z′因子值均大于0.5,且c-Fms激酶抑制剂能显著抑制EGFP-STAT3核转位的发生,提示该模型可用于c-Fms抑制剂的筛选。该模型为更广泛的激酶抑制剂筛选模型的建立提供了一种通式,为激酶抑制剂的筛选提供了一个新的思路。3)采用M-NFS-60细胞和c-Fms/GFP-STAT1U2OS细胞筛选模型,完成了34个新化合物的筛选,发现化合物LK-A051的活性明显高于阳性化合物。
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